肺纤方对博来霉素诱导肺纤维化大鼠wnt3a、β-catenin、WIF1和LRP表达的影响

董环　张晓梅　孟丽红　顾潇枫　于小林　刘彧杉　闫宏

摘要：目的  观察肺纤方对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠wnt3a、β-catenin、WIF1、LRP表达的影响，探讨其抗肺纤维化的作用机制。方法  采用气管插管滴注博来霉素制作肺纤维化大鼠模型。将120只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、泼尼松组和肺纤方高、中、低剂量组，造模次日给予相应药物灌胃。于造模后第14、28日分2批进行动物处理，Western blot检测wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表达，RT-PCR检测LRP 的mRNA表达。结果  与假手术组比较，第14、28日模型组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin、LRP表达均显著升高（P<0.05，P<0.01），第28日WIF1表达显著降低（P<0.05）;与模型组比较，肺纤方中劑量组第14、28日大鼠肺组织wnt3a、β-catenin、LRP表达显著降低（P<0.05，P<0.01），WIF1表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。结论  肺纤方具有抗肺纤维化的作用，其机制可能与抑制模型大鼠wnt3a、β-catenin、LRP的过表达和增加WIF1的低表达有关。

关键词：肺纤方;博来霉素;肺纤维化;Wnt/β-catenin信号通路;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0060-05

Effects of Feixian Formula on Expressions of wnt3a， β-catenin， WIF1 and LRP in Bleomycin-induced Pulmonary Interstitial Fibrosis in Rats

DONG Huan¹， ZHANG Xiaomei²， MENG Lihong¹， GU Xiaofeng¹， YU Xiaolin¹， LIU Yushan¹， YAN Hong¹

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To investigate the effects of Feixian Formula on the expressions of wnt3a， β-catenin， WIF1 and LRP in bleomycin （BLM） -induced pulmonary fibrosis in rats; To explore its anti-pulmonary fibrosis mechanism. Methods Intravenous intubation of BLM was used to establish pulmonary fibrosis rat models. 120 Wistar rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Prednisone group， and Feixian Formula high-， medium- and low-dosage groups. The day after model establishing， gavage was intervened with corresponding medicine. Animals were treated in two batches on the 14th and 28th day after modeling. The protein expressions of wnt3a， β-catenin and WIF1 were detected by Western blot， and the mRNA expression of LRP was detected by RT-PCR. Results Compared with sham-operation group， the expressions of wnt3a， β-catenin and LRP in lung tissue of rats in model group increased significantly on day 14 and day 28 （P<0.05， P<0.01）， and the expression of WIF1 decreased significantly on day 28 （P<0.05）. Compared with model group， the expressions of wnt3a， β-catenin and LRP in lung tissue of rats in Feixian Formula medium-dosage group decreased significantly on day 14 and day 28 （P<0.05. P<0.01）， and the expression of WIF1 increased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Feixian Formula has anti-pulmonary fibrosis effects， and the mechanism may be related to inhibiting the overexpression of wnt3a， β-catenin and LRP in rats with pulmonary fibrosis and increasing the low expression of WIF1.

Keywords：FeixianFormula; bleomycin; pulmonary interstitial fibrosis; Wnt/β-catenin pathway; rats

特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是指慢性、进行性、原因不明的肺间质性纤维化病变，其发病率为10～15人/10万人，呈明显增长趋势，缺乏有效的治疗手段、预后差^[1-3]。迄今多项研究表明，Wnt/β-catenin信号通路对组织系统的生理、病理起着至关重要的作用，包括胚胎形成、细胞增殖、细胞分化、血管生成及癌症形成等^[4-5]。Wnt/β-catenin信号通路的激活参与多种组织器官的纤维化形成过程^[6-8]。北京中医药大学姜良铎教授依据多年治疗肺纤维化的临床经验，根据其肺肾两虚、痰瘀痹阻肺络的基本病机特点，提出补肺益肾、涤痰化瘀、搜剔肺络的治疗方法，并总结出治疗肺纤维化的效方肺纤方^[9-10]。本实验通过检测肺纤方对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路wnt3a、β-catenin、WIF1和LRP表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1  实验材料

1.1  动物

清洁级雄性Wistar大鼠120只，体质量（200±20）g，购自北京维通利华动物公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。饲养于北京中医药大学东方医院实验中心清洁级动物房。

1.2  药物

肺纤方（黄芪15 g，红景天15 g，冬虫夏草3 g，炙麻黄6 g，水蛭5 g，白果10 g，瓜蒌20 g，甘遂2 g，海蛤壳30 g），饮片由北京中医药大学东方医院中药房提供，常规煎制，按每100 g体质量给药1 mL的标准制备药液。注射用博来霉素，浙江海正药业股份有限公司，15 mg/支，批号16037911;醋酸泼尼松片，天津力生制药股份有限公司，5 mg/片，批号1703035。

1.3  主要试剂与仪器

TRNzol总RNA提取试剂，天根生化科技有限公司，批号DP405-02;RIPA总蛋白提取试剂盒，美国Sigma公司，批号Cat No.R0278;PMSF，美国Sigma公司，批号Cat No. PMSF-RO;GAPDH鼠单抗，天津锐尔康生物科技有限公司，批号Cat No.REK0005;抗wnt3a 抗体，美国Thermo公司，批号Cat PA5-44946;抗β-catenin 抗体，美国CST公司，批号Cat 8480;抗WIF1抗体，美国Abcam公司，批号Cat ab155101;ECL，德国Millipore公司，批号Cat No.WBKLS0500。超声粉碎机（浙江三门超声波仪器厂），全自动显微摄像系统（日本Olympus公司），涡旋振荡仪（型号QL-902，海门市其林贝尔仪器制造有限公司），离心机（美国Eppendorf公司），分光光度计、酶标仪、电泳仪、转膜仪（美国Thermo公司），凝胶成像系统（型号Tanon 1600，上海天能科技有限公司），荧光定量PCR仪（型号ABI7500，Applied Biosystems）。

2  實验方法

2.1  分组

实验大鼠常规饲养7 d后，按随机数字表分为假手术组、模型组、泼尼松组和肺纤方高、中、低剂量组，每组20只。

2.2  造模

采用博来霉素气管插管复制肺纤维化模型^[11-12]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（45 mg/kg体质量）麻醉，仰卧位固定于手术台上，经气管插入18号大鼠导管。假手术组一次性气管内注入生理盐水1 mL/kg体质量，其余组以3 mg/kg注入博来霉素，随即注入空气0.3 mL，完毕后立即将大鼠直立、旋转，清醒后正常摄食饮水。

2.3  给药

大鼠造模次日开始常规灌胃给药，每日1次。按1 mL/100 g体质量给药标准配制药液。肺纤方高、中、低剂量组给药剂量依次为19.8、9.9、4.95 g/kg体质量，分别为成人临床用药的2、1、0.5倍，每周称重，根据体质量调整给药剂量;泼尼松组给予泼尼松药液4.2 mg/kg;模型组和假手术组给予等体积生理盐水。给药至取材前1 d。

2.4  取材

于造模后第14、28日，随机分2批1%戊巴比妥麻醉，将大鼠仰卧固定，取出肺脏，迅速放入-80 ℃冰箱冰冻，用于Western blot检测蛋白表达和RT-PCR 检测mRNA表达。

2.5  检测指标

2.5.1  wnt3a、β-catenin、WIF1蛋白表达检测

取大鼠肺组织100 mg，裂解，离心，收集上清液，提取组织总蛋白。待检测蛋白样品上样10 μg/孔;蛋白电泳;转膜至0.45 μm孔径的NC膜，转膜1 h;封闭;抗体孵育;洗膜;使用ECL发光试剂盒检测肺组织 wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表达。其中wnt3a稀释比例为1∶1000，β-catenin稀释比例为1∶1000，WIF1稀释比例为1∶2000，GAPDH稀释比例为1∶10 000。使用Image J软件对目的条带行灰度分析，计算目的蛋白相对表达量（目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值）。

2.5.2  LRP mRNA表达检测

用TRNzol总RNA提取试剂，采用Prime Script^TMRTreagent Kitwithg DNA Eraser进行cDNA反转录，再进行RT-PCR。GAPDH作为内参，上游引物序列5'CCTTCCGTGTTCCTACCCC3'，下游引物序列5'GCCCAGGATGCCCTTTAGTG3'，产物长度为131 bp;LRP上游引物序列5'CAAGGAACAAGA CCCGAGTGG3'，下游引物序列5'CCCGGCAGA AAGGGACAATA'，产物长度为158 bp。反应体系：2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L PCR特异引物F 0.5 μL，10 μmol/L PCR特异引物R 0.5 μL，加水至总体积为18 μL，将18 μL混合液加到PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2 μL cDNA。反应条件：95 ℃，30 s;40个循环（95 ℃，5 s;60 ℃，40 s），扩增反应结束后，95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，并从60 ℃缓慢加热至99 ℃，建立PCR产物相关熔解曲线，每个样品重复3次。数据采用2^ΔΔCt法进行分析。

3  统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，多组间比较，数据正态且方差齐时用方差分析，数据非正态和/或方差不齐时进行非参数检验，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  肺纤方对模型大鼠肺组织wnt3a、β-catenin和WIF1蛋白表達的影响

第14日，模型组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin蛋白表达较假手术组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），WIF1蛋白表达变化不明显，差异无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，各给药组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin蛋白表达均降低，WIF1蛋白表达均升高，肺纤方中剂量组变化最明显，差异有统计学意义（P<0.05）;与泼尼松组比较，肺纤方中剂量组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。第28日，与假手术组比较，模型组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin蛋白表达明显升高，WIF1蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与模型组比较，肺纤方各剂量组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin蛋白表达降低，WIF1蛋白表达均升高，其中肺纤方中剂量组变化最明显，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）;与泼尼松组比较，肺纤方中剂量组大鼠肺组织wnt3a蛋白表达明显降低，WIF1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见图1～图4。

4.2  肺纤方对模型大鼠肺组织LRP mRNA表达的影响

第14日时，模型组大鼠肺组织LRP mRNA表达较假手术组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠肺组织LRP mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与泼尼松组比较，肺纤方中剂量组大鼠肺组织LRP mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。第28日时，与假手术组比较，模型组大鼠肺组织LRP mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）;与模型组比较，各给药组大鼠肺组织LRP mRNA表达均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）;与泼尼松组比较，肺纤方高、中剂量组大鼠肺组织LRP mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见图5。

5  讨论

IPF是慢性、进行性和病因不明的间质性肺疾病，治疗效果欠佳。目前尚无特异性的治疗药物，糖皮质激素主要用于肺纤维化急性加重期;吡非尼酮和尼达尼布已被批准用于治疗肺纤维化，虽然可改善症状和减缓疾病进展，但因药物的高价格和不良反应，且不能完全有效降低IPF的死亡率，故其应用也受到限制^[3]。Wnt/β-catenin信号通路的激活与很多器官的纤维化发生发展密切相关，有可能成为治疗肺间质纤维化等疾病的新靶点。Wnt/β-catenin信号通路中Wnt配体包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10、Wnt10b，其中Wnt3a是Wnt经典途径的代表蛋白。Wnt/β-catenin信号通路通过胞质内的β-catenin实现调控过程，β-catenin也是上皮间质转化（EMT）的重要标志蛋白，称为间质标记蛋白，Wnt活化是激活β-catenin游离的直接因素，可直接促进EMT，而EMT又是引发肺纤维化的关键^[13]。

WIF1为Wnt分子的抑制剂，它可直接与Wnt分子结合，抑制Wnt分子和受体细胞膜上Frizzle受体及辅助受体LRP5/6形成三聚体复合物，使细胞中β-catenin磷酸化导致不能积累，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路活化;WIF1表达水平降低会导致Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，从而促进肺纤维化^[14]。故本实验研究重点为肺纤方对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠Wnt/β-catenin信号通路中相关分子表达的影响。

肺纤方中黄芪补脾肺之气，红景天性寒补气清肺活血，冬虫夏草补肾益肺，三药共奏补气之功而无助火之力;炙麻黄宣肺气，白果敛肺气，二药散敛相用，加强宣肺止喘之功;瓜蒌清热化痰，海蛤壳清肺化痰，少量甘遂泻水逐饮，三药合用，加强清肺热、化稠痰之功;水蛭破血逐瘀通络。诸药配伍，共奏补益肺肾、活血化痰功效。

本实验结果显示，第14、28日，模型组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin、LRP呈高表达，WIF1呈低表达。表明肺组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活，且随着肺纤维化的形成，Wnt/β-catenin信号通路活化程度更为明显。其中WIF1第14日模型组与假手术组无显著差异，第28日显著降低，可能WIF1主要作用于肺纤维化时期，而炎症时期对其表达无明显影响;泼尼松组治疗后wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表达与模型组比较未见显著差异，而LRP mRNA表达与模型组比较显著降低，提示泼尼松组可能主要作用于LRP受体;肺纤方各剂量组wnt3a、β-catenin、LRP表达均较模型组水平低，WIF1表达均较模型组水平高，其中以肺纤方中剂量组最为明显，提示肺纤方作用优于泼尼松，其效应机制可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化，进而发挥抗纤维化的作用。

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