慈菇消脂丸对非酒精性脂肪性肝炎模型大鼠JNK1、p-c-Jun和Caspase-8表达的影响
2019-09-30马燕花师霞韩涛余臣祖武燕
马燕花 师霞 韩涛 余臣祖 武燕
摘要：目的 觀察慈菇消脂丸对非酒精性脂肪性肝炎模型大鼠JNK1、p-c-Jun、Caspase-8表达的影响，探讨其相关作用机制。方法 实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组和慈菇消脂丸高、中、低剂量组，每组10只。采用高脂饲料喂养大鼠制作非酒精性脂肪性肝炎模型大鼠，造模同时给予相应药物干预。造模12周后处死全部大鼠，取出肝脏。电镜观察肝细胞超微结构，TUNEL法检测肝细胞凋亡，qRT-PCR和Western blot分别检测肝组织JNK1、p-c-Jun、Caspase-8 mRNA和蛋白的表达。结果 电镜观察显示，模型组大鼠肝细胞肿胀呈气球样变，胞浆中布满众多大小不一的脂滴。与正常组比较，模型组大鼠肝细胞凋亡显著增加，JNK1、p-c-Jun、Caspase-8 mRNA和蛋白表达显著升高;与模型组比较，慈菇消脂丸各剂量组和阳性对照组大鼠肝细胞脂肪样变显著减少，细胞凋亡显著下降，JNK1、p-c-Jun、Caspase-8 mRNA和蛋白表达显著降低。结论 慈菇消脂丸通过调节JNK信号通路抑制肝细胞凋亡，对非酒精性脂肪性肝炎模型大鼠有一定的治疗作用。
关键词：非酒精性脂肪性肝炎;慈菇消脂丸;JNK信号通路;凋亡;大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）09-0055-05
Effects of Cigu Xiaozhi Pills on Expressions of JNK1， p-c-Jun and Caspase-8 in Non-alcoholic Steatohepatitis Model Rats
MA Yanhua， SHI Xia， HAN Tao， YU Chenzu， WU Yan
Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China
Abstract： Objective To observe the effects of Cigu Xiaozhi Pills on the expressions of JNK1， p-c-Jun and Caspase-8 in non-alcoholic steatohepatitis （NASH） model rats; To discuss its related mechanism of action. Methods Totally sixty SPF grade male SD rats were divided into six groups randomly： normal control group， model group， positive medicine group， Cigu Xiaozhi Pills high-， medium- and low-dosage groups， with 10 rats in each group. NASH model was established by feeding rats with high fat diet. At the same time， the model rats were given medicine intervention. At the end of 12 weeks， all the experimental rats were killed and the livers were taken. The ultrastructure of liver cells was observed by transmission electron microscope. Hepatocyte apoptosis was detected by TUNEL method. The expressions of JNK1， p-c-Jun， Caspase-8 mRNA and protein in liver tissue were detected by qRT-PCR and Western blot. Results Under electron microscope， the liver cells in the model group were swollen in balloon shape， and the cytoplasm was covered with numerous fat droplets of different sizes. Compared with the normal group， the apoptosis of hepatocytes significantly increased， and the expressions of JNK1， p-c-Jun， Caspase-8 mRNA and protein significantly increased in the model group. Compared with the model group， the adipose samples of hepatocytes in each Cigu Xiaozhi Pills group and positive medicine group decreased significantly; the apoptosis rate decreased significantly; the expressions of JNK1， p-c-Jun， Caspase-8 mRNA and protein decreased significantly. Conclusion Cigu Xiaozhi Pills can inhibit hepatocyte apoptosis by regulating the JNK signal pathway and play a therapeutic role in NASH.
Keywords：non-alcoholic steatohepatitis;Cigu Xiaozhi Pills; JNK signal pathway; apoptosis; rats
非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是非酒精性脂肪性肝病的重要临床病理类型之一，其组织学具有肝细胞脂肪变、气球样变性和点状坏死及混合性炎性细胞浸润的特征，可伴Mallory小体和不同程度的肝纤维化。研究表明，10%～25%单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）患者将进行性发展为NASH。30%～40%NASH合并进展性肝纤维化，10%～15%NASH患者可进展为肝硬化，而9%～26%NASH相关肝硬化患者在随访4～10年内死亡[1-2]。NASH发病机制复杂，涉及脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、肝脂质过氧化增加和细胞因子异常等多个相互关联的病理生理环节。研究发现，细胞凋亡是NASH的突出特点，肝细胞凋亡与脂肪肝严重程度密切相关，肝脏脂肪变越重，炎症反应越重，肝细胞凋亡也越多[3]。前期临床和实验研究均显示，慈菇消脂丸在治疗脂肪性肝病、肝纤维化、高脂血症及肥胖等方面已取得较好的疗效，明显减轻NAFLD肝组织脂肪变性程度及炎症反应，对NAFLD具有确切的干预效应[4-5]。本实验观察慈菇消脂丸对NASH模型大鼠JNK1、p-c-Jun、Caspase-8表达的影响，探讨其相关作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性健康SD大鼠60只，8周龄，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于温度（22±2）℃、相对湿度50%～60%环境，12 h明暗交替照明。
1.2 药物及制备
慈菇消脂丸（山慈菇10 g、法半夏15 g、土鳖虫20 g、茯苓20 g、柴胡12 g、丹参20 g、薏苡仁30 g、黄芩10 g、泽泻15 g、枸杞子20 g、山楂20 g等），饮片由甘肃中医药大学附属医院制剂中心提供。饮片用2 L冷蒸馏水浸泡30 min后，武火煮沸，改用文火保持沸腾煎煮30 min，过滤后，药渣再加1.5 L冷蒸馏水煎煮1次，煮沸后保持沸腾30 min，过滤，合并2次滤液，放置过夜，离心，去除沉淀，电炉上用蒸发皿浓缩上清液，浓缩成3.6 g/mL为高剂量，稀释1倍（1.8 g/mL）为中剂量，稀释2倍（0.9 g/mL）为低剂量，4 ℃冰箱保存备用。JNK抑制剂（SP600125，美国Santa Cruz公司）按0.5 mg/kg剂量用10 mL/L DMSO溶解，按5 mL/kg腹腔注射。
1.3 主要试剂与仪器
DMSO，美国Santa Cruz公司;Mab to JNK1抗体，美国Abcam公司，批号GR114659-3;Pab to JNK1抗体，美国Abcam公司，批号GR45117-7;p-c-Jun抗体，美国Abcam公司，批号GR3190868-1;Caspase 8抗体，美国GeneTex公司，批号Lot No.40044;β-actin，北京中杉金桥公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒，Solarbio公司，批号Lot No.20170802;PrimeScriptTMRT Master Mix （Perfect Real Time）、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）、TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，TaKaRa公司。實时定量Applied Biosystems Q5仪，美国Thermo Fisher Scientific公司;Thermo-NANO核酸浓度测量仪，上海创萌生物科技有限公司;Western blot转膜仪、电泳仪，Bio-rad公司;酶标仪，Thermo公司;HITACHI-HS500透射电镜，日本HITACHI公司。
2 实验方法
2.1 分组
60只大鼠标准食水适应性喂养7 d，随机分为正常组、模型组、阳性对照组和慈菇消脂丸高、中、低剂量组，每组10只。
2.2 造模和给药
参照文献[6]方法，采用高脂饲料喂养制作模型。正常组给予普通标准饲料，同时按10 mL/kg鼠质量灌服生理盐水，每日1次;模型组给予高脂饲料喂养，同时按10 mL/kg鼠质量灌服生理盐水，每日1次;慈菇消脂丸各剂量组在高脂饲料喂养的同时给予10 mL/kg体质量相应浓度药液灌胃，每日1次;阳性对照组在高脂饲料喂养的同时，第9周开始按5 mL/kg腹腔注射SP600125溶液，1次/d，连续4周。动物给药剂量按人与动物体表面积比折算成等效剂量。实验持续至12周末结束。大鼠禁食24 h，次日10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速取出肝脏。一块置于4%多聚甲醛液中固定，石蜡包埋;一块经冷生理盐水清洗后铝箔包裹置于液氮内速冻，-80 ℃冰箱保存备用。
2.3 观察指标
2.3.1 电镜观察
取肝组织块切成约1 mm3，用配好的电镜固定液固定，漂洗，逐级脱水、浸透、固化、LKB型超薄切片机切片50～60 nm，枸橼酸铅染色，透射电镜观察肝细胞及细胞外基质超微结构。
