CBLN1基因在肝癌中的表达情况及其对DCC通路调控作用的研究

龚静 张清华

[摘要] 目的 探討CBLN1基因与肝癌转移的关系，阐明肝癌患者中CBLN1基因表达差异对DCC通路的调控作用。方法 采用RT-PCR 法检测2017年1月～2018年12月于本院住院的 41对肝癌患者术后肝癌和癌旁组织中CBLN1基因的表达水平;通过Western-blot方法检测CBLN1蛋白在肝癌中的表达情况。采用小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术沉默肝癌PLC/PRF/5细胞株中 CBLN1 基因的表达，并观察对PLC/PRF/5细胞增殖、迁移的影响;采用在Huh-7细胞株中是否过表达CBLN1质粒方法，观察对Huh-7细胞DCC表达及细胞增殖、迁移的影响。 结果 在41对收集的肝癌和癌旁组织中，30对肝癌样本中CBLN1表达显著增高（P<0.05）。在转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3质粒的细胞中CBLN1表达被沉默[2]，使得PLC/PRF/5细胞的迁移受到了抑制;在CBLN1过表达的Huh-7细胞株中DCC表达显著降低（P<0.05），而转染CBLN1质粒48 h后Huh-7细胞株的迁移能力明显提升。 结论 抑制CBLN1基因表达肝癌细胞的生长受到抑制，过表达CBLN1基因可能促进了肝癌细胞的迁移，抑制了肝癌细胞DCC的表达，提示CBLN1与肝癌转移有关，其调控肝癌转移与DCC信号通路相关，并为提供潜在的临床诊断与药物治疗的新靶点。

[关键词] 肝癌 ;CBLN1基因;信号通路;功能

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）20-0015-04

Study on the expression of CBLN1 gene in hepatocellular carcinoma and its regulatory function on DCC pathway

GONG Jing   ZHANG Qinghua

Department of Clinical Laboratory， Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Western and Chinese Medicine， Nanchang   330003， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between CBLN1 gene and metastasis of liver cancer， and to elucidate the regulatory effect of CBLN1 gene expression on DCC pathway in the patients with liver cancer. Methods The expression levels of CBLN1 gene in postoperative liver cancer tissues and paracancerous tissues of 41 pairs of patients with liver cancer who were admitted to our hospital from January 2018 to February 2018 were detected by RT-PCR method; the expression of CBLN1 protein in liver cancer was detected by Western-blot method. The expression of CBLN1 gene in liver cancer PLC/PRF/5 cell line was silenced by small interfering RNA （siRNA） technique， and the effect on the proliferation and migration of PLC/PRF/5 cells was observed; the method of whether the CBLN1 plasmid was overexpressed in the Huh-7 cell line was used， and the effects of DCC expression， cell proliferation and migration on Huh-7 cells were observed. Results Of the 41 pairs of collected liver cancer tissues and paracancerous tissues，CBLN1 expression was significantly increased in 30 pairs of liver cancer samples（P<0.05）. CBLN1 expression was silenced in cells transfected with siRNA-1， siRNA-2， and siRNA-3 plasmids， resulting in inhibition of PLC/PRF/5 cell migration; DCC expression was significantly decreased in CBLN1 overexpressing Huh-7 cell line （P<0.05）， and the migration ability of Huh-7 cell line was significantly increased after transfection of CBLN1 plasmid for 48 h. Conclusion The growth of liver cancer cells was inhibited when inhibiting the expression of CBLN1 gene. Overexpression of CBLN1 gene may have promoted the migration of liver cancer cells and inhibit the expression of DCC in liver cancer cells， suggesting that CBLN1 is involved in liver cancer metastasis. Its regulation of liver cancer metastasis is associated with DCC signaling pathway and serves as a new target for potential clinical diagnosis and drug therapy.

[Key words] Liver cancer; CBLN1 gene; Signal pathway; Function

肝细胞癌（Human hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一。在世界范围内，肝癌在男性及女性中发病率分别位列第五位及第七位，在癌症死亡率中则分别列第二位及第六位，其中有约半数患者来自中国[1]。因此深入研究肝癌发病和转移的机制，对我国居民健康具有重大意义。本课题组前期的肝癌研究工作中，通过cDNA基因芯片筛选，发现肝癌中CBLN1基因表达明显上调，但目前CBLN1在肝癌及其他肿瘤中尚未见报道，通过进一步研究发现CBLN1与DCC通路可能关联，并促进肝癌细胞增殖与迁移，推测CBLN1可能调控肝癌转移相关DCC通路，促进肝癌转移。

在本实验前期的肝癌研究工作中，通过cDNA基因芯片筛选，发现肝癌中CBLN1基因表达明显上调。与DCC通路相关联，与肝癌细胞株的增殖和迁移相关，推测CBLN1可能调控肝癌侵袭转移相关通路DCC通路，促进肝癌转移，具体机制尚不明确。本研究观察CBLN1基因在肝癌中的表达情况;研究CBLN1对DCC信号通路相关蛋白及其下游蛋白的作用，对侵袭转移的影响，并初步阐明其调控机制。

1 资料与方法

1.1 样本采集及细胞分组

检测CBLN1、DCC基因在肝癌及其对应癌旁组织中的表达，本研究中所用41对肝癌及其对应的癌旁组织来自本院2017年1月～2018年12月入院的肝癌患者，且均是HBV阳性的原发性肝细胞癌手术患者。纳入标准：①符合全国肝癌学术会议制定的《原发性肝癌的诊断标准》中肝癌的诊断标准;②经病理学确诊为肝癌;③术前患者均未接受过放疗、化疗或生物治疗等干预措施;④签署知情同意书。排除标准：①并发其他恶性肿瘤者;②严重的肝肾功能异常者;③严重的认知功能异常者;④严重的代谢系统疾病者[2]。手术样本的留取均征得患者认可。手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及离病灶至少5 cm以上的周围正常组织，放入液氮中保存;作为确诊的最终病理诊断依据。取Huh-7細胞分为两组：GFP组：转染GFP空载质粒的细胞株;CBLN1组：转染CBLN1质粒的细胞株。取PLC/PRF/5细胞分为四组：siRNA-NC组、siRNA-1组、siRNA-2组、siRNA-3组，分别为转染对应质粒的PLC/PRF/5细胞。将处于对数生长期的细胞接种于6孔板中，细胞密度生长至70%，按lipofectamin 2000说明书转染细胞。用250 μL不含血清培养基Opti-MEM稀释100 pmol相应质粒（加入细胞中的终浓度50 nM），混匀，室温孵育5 min;用250 μL不含血清培养基Opti-MEM稀释5 μL lipofectamin 2000，混匀并室温孵育5 min;将以上两者混匀，室温孵育20 min加入至细胞培养孔中;37℃，5% CO2培养6～8 h后，换完全培养基，培养24～48 h后，进行后续实验。

1.2 RT-PCR检测

采用trizol分别抽提获得的肝癌和癌旁组织总RNA，用紫外分光光度计测定其浓度后，各取2 μg总RNA，设计β-ACTIN、CBLN1、DCC引物。将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HiFi-MMLV和无RNA酶水置于冰上溶解备用。逆转录体系20 μL，参照TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer 说明书进行，设定反应条件为：42℃，30～50 min（逆转录反应），85℃ 5 s（逆转录酶失活反应）。取反应液进行荧光定量PCR，参照SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒说明书进行荧光定量PCR操作。反应体系50 μL：SYBRR Premix Ex TaqTM II（2×）25 μL，PCR上游引物2 μL，PCR下游引物2 μL，ROX Reference Dye（50×）1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O16 μL。在ABI系统进行荧光定量PCR，反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，循环40次后72℃延伸1 min。以β-ACTIN为内参。2-ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系，公式如下：ΔΔCT=ΔCt实验组-ΔCt对照组。Ct为反应的实时荧光强度达到设定的阈值时所经过的扩增循环数，此时扩增是呈对数期增长，此处实验重复3次。

1.3 组织芯片（tissue microarray，TMA）

选取获得的肝脏组织，采用石蜡包埋的组织微阵列。运用荧光原位杂交（FISH技术;使用组织芯片点样仪将标记好的组织按设计排列在空白蜡块上，利用打孔机在已经标记好的靶位点上进行打孔，将组织芯转入蜡块孔中，重复操作可转入上千个样品组织芯。使用切片机对阵列蜡块进行连续切片即获得组织芯片。利用荧光显微镜进行观察，检测后标记出待研究的区域进行拍片分析。

1.4 Western-blot检测

采用总蛋白提取液RIPA试剂盒提取总蛋白。用预冷的PBS洗涤转染后的细胞3遍。每个细胞瓶中加入适量的蛋白裂解液，收集于EP管中，冰上静置裂解30 min。于4℃，13500 rpm离高速冷冻离心机中心30 min，收集上清液，置于冰盒上，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。然后使用SDS-PAGE凝胶试剂盒配制10%分离胶和5%积层胶，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离转至NC膜上，5% BSA室温下封闭1 h。滴加稀释的鼠抗人β-ACTIN和稀释的兔抗人CBLN1，以上均来自Abcam。4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，孵育与一抗相对应的二抗用5%脱脂牛奶稀释二抗，孵育1 h后再次用TBST洗膜3次，加入显影剂并通过bio-Rad凝胶成像系统显影，使用IPP7.0软件进行定量分析。CBLN1条带与内参β-ACTIN灰度值的比值代表各自的含量。此实验重复3次。

1.5 Transwell实验

取Transwell小室放入24孔板内，用Matrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，室温下风干;各组细胞常规消化后，用PBS漂洗2次后DMEM培养基重悬，细胞密度调整至1×105个/mL，取细胞悬液200 μL加入已铺Matrigel胶的Transwell小室的上室，将600 μL含20%胎牛血清的DMEM培养基加入下室;常规培养24 h后，取出Transwell小室，用棉签擦去上室内面的细胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%结晶紫溶液（用甲醇配制）染色15 min，PBS洗3遍，用倒置显微镜随机选取5个视野（200×）进行拍照。拍照后用33%冰醋酸300 μL溶解膜上的结晶紫，酶标仪测定D573。穿膜细胞计数。每组设置3个复孔，重复3次，取平均值。

1.6 统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行实验数据的分析。所有数据均进行正态性分布和方差齐性检验，符合正态性分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示。组间两两比较采用t检验，偏态分布数据采用非参数检验Wilcoxon符号秩检验。多组间比较采用单因素方差分析。计数资料采用[n（%）]，数据分析采用χ2检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CBLN1基因在肝癌及癌旁组织中的表达情况

在30对肝癌和癌旁样本中通过RT-PCR验证CBLN1基因表达增高的比例为83.3%（封三图1A）。并进行肝癌组织芯片检测，其中组织芯片检测包括41对肝癌和癌旁组织标本。结果提示，在41对肝癌和癌旁组织中，30对肝癌样本中CBLN1表达显著增高，比例为73.2%。表达差异显著的肝癌组织样本26N/C的高倍镜视野图如图所示（封三图1B）。

通过CBLN1的过表达研究发现，当CBLN1过表达的Huh-7细胞株中DCC表达显著降低，说明这两个基因表达存在相关性（封三图2），CBLN1在肝癌发生发展中与DCC通路可能存在密切联系。

2.2 CBLN1肝癌细胞的增殖与迁移的相关性

研究利用CBLN1的siRNA转染PLC/PRF/5细胞株。RT-PCR证实，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3位点的干扰效果较满意（封三图3B），软琼脂克隆形成实验观察到瞬间转染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3抑制了PLC/PRF/5细胞的迁移（封三图3A）。当干扰CBLN1时肝癌细胞增殖和贴壁生长均减少，提示CBLN1促进肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞贴壁非依赖性的生长。

当过表达CBLN1的质粒以及空载对照质粒转染到Huh-7细胞株，经Western验证（封三图3C）发现未转入CBLN1质粒的细胞没有表达对应基因;转染48 h后进行细胞迁移能力的测定，结果显示过表达CBLN1能够增加Huh-7细胞株的迁移能力（封三图3D）。

3 讨论

CBLN1（cerebellin 1 precursor）是定位于16q12.1，能够编码小脑肽前体蛋白（cerebellin 1 precursor protein，precerebellin，CBLN1）。1991年，Urade Y等首次报道小脑颗粒细胞分泌产生的precerebellin经蛋白水解生成小脑肽（cerebellin）维持小脑功能[3]。CBLN1是补体C1q/肿瘤坏死因子（C1q/TNF）超家族成员之一[4，5]。CBLN1自小脑颗粒细胞分泌释放后，形成多聚体，到达平行纤维-浦肯野细胞突触后位点，特异地结合于突触后膜的特异受体，促进突觸发生。小鼠小脑浦肯野细胞上的谷氨酸盐delta2孤儿受体（orphan delta2 glutamate receptors，GluRdelta2）通过CBLN1链接突触前的轴突蛋白（neurexins，NRXNs），形成GluRdelta2-Cbln1-NRXNs三联体，是突触形成的关键结构[6-8];是体内促进平行纤维-浦肯野细胞突触形成的强诱导剂。在突触形成过程中，平行纤维延伸出的突起能够促进突触成熟，利用CBLN1能够打开和关闭平行纤维与浦肯野细胞之间的连接[9]。CBLN1蛋白在小脑、丘脑、纹状体等多个脑区域中作为粘附分子促进突触形成，维持突触功能。CBLN1蛋白本来就是一种新的神经传递因子，对于癌细胞该基因的表达增加，可能促进相关信号通路，促进细胞的增殖、迁移。

抑癌基因DCC（deleted in colorectal carcinoma）1990年由Fearon ER等[10]在结直肠癌中首次报道。随后研究发现其在多种肿瘤中发挥抑癌作用。2012年发表于《Nature》的最新文献报道DCC抑制乳腺癌的转移[11]。DCC表达蛋白的胞外配体是神经生长因子Netrin-1，胞内区信号传导区包括Caspases切割位点。作为依赖性受体，缺乏轴突导向配体Netrin-1时，DCC-Caspase活化复合体诱导细胞凋亡[12]，Netrin-1存在时，能够通过泛素-蛋白酶体途径降解细胞表面的DCC，抑制细胞凋亡[13]，促进肿瘤转移。既往文献报道，DCC杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）是肝细胞肝癌发生的早期改变之一[14]。DCC在肝癌组织中呈现显著高甲基化改变，与肝癌的发生发展相关[15]。肝癌细胞的增殖迁移等可能与Netrin1-DCC信号通路有密切联系。

在前期的研究中观察到CBLN1基因在肝癌中表达显著增高，与DCC通路相关联，与肝癌细胞株的增殖与迁移相关，本研究发现CBLN1可能调控肝癌转移相关DCC信号通路，促进肝癌转移。通过cDNA基因芯片筛选，发现肝癌中CBLN1基因表达明显上调。而且在肝癌和癌旁样本的CBLN1基因表达相比其增高达83.3%，肝癌组织芯片检测提示肝癌标本中CBLN1表达显著增高比例为73.2%。提示CBLN1与肝癌的发生发展可能相关。通过过表达CBLN1的质粒，发现CBLN1过表达的Huh-7细胞株中DCC表达显著降低，二者基因表达存在关联，提示CBLN1在肝癌中与DCC通路可能相关。另外，针对CBLN1的siRNA干扰PLC/PRF/5细胞株的内源性表达，软琼脂克隆形成实验观察到瞬间转染siRNA抑制PLC/PRF/5细胞的增殖。提示干扰CBLN1过表达CBLN1基因可能促进了肝癌细胞的迁移表达会抑制肝癌细胞增殖，减少肝癌细胞贴壁非依赖性的生长。实体瘤细胞都是以贴壁方式进行生长，当癌细胞发生转移时，则以循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的方式通过血液循环运行，表现出贴壁非依赖的存活特性[16]。本研究在软琼脂克隆形成实验观察到CBLN1促进肝癌细胞贴壁非依赖性的生长，提示与肝癌细胞的迁移相关。为进一步验证CBLN1对肝癌细胞迁移的影响，用CBLN1的过表达质粒转染Huh-7细胞，转染48 h后细胞迁移能力测定显示过表达CBLN1能够增加Huh-7细胞的迁移能力。

本研究以CBLN1基因作为主要研究对象，检测肝癌患者中CBLN1基因表达差异、对DCC通路的调控作用、CBLN1基因异常表达的机制及功能的变化，明确CBLN1与肝癌转移的关系，初步阐明其调控肝癌转移相关DCC信号通路的机制，为肝癌的研究提供新的思路，并提供潜在的临床诊断与药物治疗的新靶点。但是，调控DCC信号通路的上下游具体情况，还有待进一步深入研究。

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