肺癌患者血清miRNA-22表达水平及临床意义探讨

杨侠 张秋红 苏文媚 张明 单虎 张洁 陈国安 郭春芳 李雅莉

1西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科710004;2广东医科大学附属医院肿瘤科,湛江524000;3南方科技大学医学院,深圳518000;4美国密西根大学胸外科,安娜堡48109

肺癌是目前世界范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之首[1]。肺癌的临床分型包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。二者不仅在临床占比上明显不同(NSCLC：80%～85%;SCLC：15%～20%),而且在恶性程度、病情进展、临床治疗和预后等方面也迥然相异[2]。近年来,随着抗肿瘤靶向药物及免疫治疗的应用,肺癌患者的整体生存期显著提高,但目前约75%的肺癌患者在就诊时已属中晚期,整体5年生存率仍仅为15%左右,缺乏有效的早期诊断是主要原因之一[3]。美国癌症学会发布的最新数据显示,经过规范治疗后,原位癌患者治愈的可能性近100%,而随着病情的进展,Ⅰ～Ⅳ期肺癌患者的5年生存率从88%骤降为2%～15%[4-5]。因此,提高肺癌的早期诊断率已成为世界范围内的共识。肺癌起病隐匿,早期常因缺乏典型症状而错过最佳诊治时间。一直以来,胸部X 线片、痰涂片和癌胚抗原检查是筛查吸烟等肺癌高危人群的主要方式,但收效甚微。2011年美国国家肺癌筛查研究小组等[6]在《新英格兰医学杂志》上发表了一篇具有开创意义的报道,显示在肺癌高危人群中使用低剂量CT(low-dose CT,LDCT)进行肺癌筛查比胸部X 线片筛查相对死亡率降低20%。自此,LDCT 成为早期肺癌筛查的重要手段之一,但近些年的研究数据表明,LDCT 筛查试验存在漏诊和过度诊断之嫌,费用也高居不下,因此,开发新的实用且性价比高的肺癌诊断方法已成为当务之急[7]。

miRNAs是一类长度为20～22个核苷酸的非编码RNA 分子,于1993年首次在新秀丽线虫内发现[8]。miRNAs通过其3'端的UTR 区与目的基因的m RNA 相互作用,在转录后水平选择性降解m RNA 或抑制基因翻译进而实现调节目的基因的表达。近年来大量的研究表明,miRNAs表达失调与包括肺癌在内的许多人类癌症的发生、发展密切相关。miRNAs不仅在进化上具有高度的保守性、时序性、组织和细胞特异性,而且存在于循环体液中(组织液、痰液、血液等)的miRNA(循环miRNA),对严苛的体内外环境(高温、高p H值、反复冻融等)和对抗RNA 酶消化等方面表现出极强的耐受性和稳定性,因此,上述这些优点使循环miRNAs 有望成为肿瘤诊断的潜在标记物[9-11]。尤其在目前肺癌的早期筛查诊断缺乏行之有效的手段下,探索发现新的潜在的肺癌miRNA分子标记物已成为国内外广大科研工作者的研究方向。

本课题组前期与美国密西根大学胸外科合作,在对54例肺癌患者和47例健康对照人群的血清样本进行胸外科分析发现,miR-22在肺癌患者的血清中表达明显升高。为了进一步验证这一结果的可靠性,我们又重新募集了另一组独立且扩大的血清样本,采用荧光定量PCR 分析,对肺癌患者和非肺癌患者外周血中miR-22 水平进行比较,探讨miR-22在肺癌患者中的表达及其诊断价值。

1 对象与方法

1.1研究对象及标本来源 募集2011～2017年密西根大学医学院收治并确诊的126例肺癌患者作为肺癌组,其中NSCLC 116 例(腺癌77 例、鳞癌22例、大细胞癌17例)和SCLC 10例;Ⅰ期68例,Ⅱ期25 例,Ⅲ期17 例,Ⅳ期7 例。此外,152例非肺癌对照组选自密西根大学医学院同期性别、年龄相近的非肺癌患者103 例(肺良性结节26例、COPD29例、系统性红斑狼疮48例)及健康人群49例。肺癌组和非肺癌对照组性别、年龄及吸烟状况匹配。本研究通过美国密西根大学健康伦理委员会审查批准(00004969),且所有研究对象均签署知情同意书后,肺癌组患者收集3～5 ml治疗前(包括术前)血液样本,非肺癌对照组均门诊采集相应的血液样本,于采血后1 h内将所有血液样本经1 000×g,4℃离心15 min后,分离血清,每个试管300μl分装保存于-80℃冰箱内待用。

1.2血清总miRNA 提取和miR-22的检测

1.2.1总miRNA 的提取 200μl血清总miRNA经miRNA 提取试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit,美国Qiagen 公司)提取,经分光光度计(Nanodrop 2000 spectrophotometer,美国Thermo Scientific公司)检测提取RNA 的浓度和纯度,当A260/280比值为1.9～2.1时认为提取的RNA 纯度合格。

1.2.2miR-22表达检测 100 ng总RNA 经反转录试剂盒(miScript ⅡRT Kit,美国Qiagen 公司)产生cDNA。荧光定量PCR 反应检测miR-22表达水平(miScript SYBR®Green PCR Kit,美国Qiagen公司)。反应条件为：95℃预变性15min,94℃变性15 s,55℃退火和70℃延伸多30 s,共40个循环。miR-22 引物购自美国Invitrogen 公司。采用Cel-miR-39作为外参,miR-22相对表达量以log(2-ΔΔCt)表示。

1.3统计学分析 采用GraphPad Prism 6、Excel和R 软件对数据进行分析。所有数值均以±s表示。试验资料中的计量资料均做正态性检验,其中符合正态分布的资料,多组间的比较采用单因素方差分析、LSD 和HSD 法;不符合正态分布的资料则采用Mann-Whitney 秧和检验比较两组间各指标。受试者工作特征曲线及其曲线下面积(area under curve,AUC)评价miR-22在肺癌及其各亚型或各临床分期的患者与非肺癌对照组人群的诊断价值。约登指数用于选取临界诊断阈值以及其对应的敏感度和特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血清miR-22在肺癌组和非肺癌对照组中的表达 血清miR-22 在NSCLC 患者、SCLC 患者和非肺癌对照组中的相对表达量分别为1.63±1.43、1.10±1.64和-0.02±1.31,NSCLC 患者miR-22表达高于SCLC患者及非肺癌对照组(F=49.35,P＜0.01),SCLC 患者与非肺癌对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),见图1。

图1 非小细胞肺癌患者、小细胞肺癌患者和非肺癌对照组中血清miR-22的表达

2.2miR-22 在NSCLC 患者各临床分期中的表达 NSCLC患者Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期血清miR-22的相对表达量分别为1.65±1.36、1.49±1.60和1.0±1.42,与非肺癌对照组比较均升高(P值均＜0.05),各期肺癌之间比较差异均无统计学意义(P值均＞0.05),见图2。

图2 非小细胞肺癌各临床分期与非肺癌对照组血清miR-22的表达比较

2.3miR-22 的表达与NSCLC 病理型之间的关系 NSCLC患者不同病理亚型(腺癌、鳞癌和大细胞癌)之间miR-22相对表达量比较,差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。非肺癌对照组中肺良性结节、COPD、系统性红斑狼疮和健康人群之间进行比较,差异均无统计学意义(P值均＞0.05),见图3。

图3 肺癌各病理类型以及非肺癌对照组各亚群之间血清miR-22表达比较

2.4NSCLC患者血清miR-22 受试者工作特征曲线分析 miR-22在NSCLC 患者中的AUC 为0.80(95%CI：0.75～0.85,P＜0.001),当设定最佳临界值后,miR-22 诊断NSCLC 的敏感度和特异度分别为73.03%和70.69%。miR-22 在NSCLC患者各病理亚型以及各临床分期中的AUC为0.72～0.82。当分别取最佳临界值时,敏感度为70.59%～75.32%,特异度为54.61%～73.03%(图4、图5、表1)。

表1 非小细胞肺癌患者工作特征曲线分析及敏感度和特异度

3 讨论

近年来,包括靶向药物广泛应用在内的肺癌治疗水平呈现出极大的进步,但迄今为止,肺癌依旧是我国乃至全球范围内的发病率和病死率最高的恶性肿瘤。究其原因,缺乏有效的早期诊断方法是其重要桎梏之一,因此提高肺癌的早诊率成为当今亟待解决的重大课题。miRNAs是一类长度为20～22个核苷酸的非编码RNA 分子,随着miRNA 与肿瘤相关性的报道不断扩大和深入,尤其是稳定存在组织或血液(血清、血浆和血细胞)里的miRNA,成为极具前途的肿瘤标记物[12-14]。

图4 受试者工作特征曲线分析miR-22在及其各病理类型中的诊断意义

图5 受试者工作特征曲线分析miR-22在非小细胞肺癌各临床分期中的诊断意义

我国李玺等[15]收集NSCLC 患者32例,获取EBUS-TBNA 标本,采用实时定量PCR 方法检测miRNA-21、miRNA-126、miRNA-155、miRNA-200c、miRNA-205和miRNA-375的表达水平,证实6 种 miRNA 对 NSCLC的诊断有价值,miRNA-21、miRNA-155和miRNA-205可能还具有鉴别肺鳞腺癌的作用。意大利学者报告了两项关于血清/血浆miRNA 检测用于肺癌筛查的大规模验证性研究[16-17]。Sozzi等[17]以870例健康者和69例肺癌患者为研究对象,通过检测吸烟者血浆24种miRNA 来诊断肺癌,发现敏感度达到87%,特异度达到81%。miRNA 检测和LDCT 联合应用可使LDCT 假阳性率降低5倍,达到3.7%。另一项研究在肺癌高危人群(1 067例无癌个体和122例癌症患者)中联合检测13种miRNA,结果提示准确率、敏感度和特异度分别为74.9%、77.8%和74.8%,AUC为0.85[16]。Moretti等[18]对20项研究的系统回顾表明,用于肺癌检测的各种miRNA的AUC 范围为0.62～0.94。这些研究证实了miRNA 作为循环肿瘤标记物在肺癌诊断、预后或监测方面的潜在价值。

miR-22位于17p13 染色体,在进化上相对保守。大量研究表明,miR-22不仅在生物学上影响衰老、血管生成、上皮间质细胞转化以及细胞增殖、侵袭、转移和凋亡等过程,而且,miR-22 通过其表达上调或下调参与不同癌症的发生、发展,如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌,并在不同遗传背景下发挥促癌或者抑癌的双重作用[19-21]。此外,研究还表明,循环miR-22的异常表达在癌症早期即可出现,有些还随着癌症进展而波动,呈现出时间的差异性,这些特征使miR-22具有作为潜在肿瘤标记物的特征,对肿瘤的早期诊断、治疗、疗效和预后的评估产生深远的影响。

本研究首先进行了肺癌组和非肺癌对照组血清miR-22相对表达量之间的比较。结果显示,血清miR-22在肺癌患者尤其NSCLC 患者中的相对表达量明显高于非肺癌对照组。Ⅰ期肺癌患者血清miR-22水平明显高于非肺癌对照组,提示miR-22在早期肺癌患者中的表达即明显升高,为miR-22作为潜在的肺癌早期诊断标记物提供了实验基础。本研究还发现miR-22的表达只与占肺癌总数绝对优势的NSCLC相关,NSCLL各病理亚型(腺癌、鳞癌和大细胞癌)之间miR-22相对表达量比较差异均无统计学意义。此外,非肺癌对照组各亚组(系统性红斑狼疮、肺良性结节、COPD与健康人群)之间miR-22相对表达量比较,差异无统计学意义,该结果进一步支持miR-22不受多种良性疾病的干扰,提高了其作为NSCLC 诊断标记物的特异性。研究进而以全部非肺癌对照组作为阴性对照,通过分析NSCLC 患者AUC,评估血清miR-22在NSCLC 诊断中的价值。结果提示NSCLC患者及其各病理类型、各临床分期的AUC数值在0.72～0.82之间,证实血清miR-22具有较好的肺癌诊断应用价值。

综上所述,血清miR-22水平对肺癌早期诊断具有重要意义,作为非侵袭性的检测手段,miR-22有望成为肺癌辅助诊断的新指标。本课题组将进一步检测肺癌患者治疗(包括手术、靶向治疗、化疗、免疫治疗)前后血清miR-22水平的变化,进一步探索miR-22在肺癌发生、发展中的重要作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突