双氢青蒿素联合顺铂活化Caspase-6、Lamin A/C表达诱导H1299细胞凋亡

田祺 高立明 尹小波 徐淑凤 赵靖 刘菲菲 罗坤 石珊珊

秦皇岛市第一医院呼吸一科066000

肺癌的发病率在全世界范围都在逐渐升高,它也是全世界癌症相关死亡的主要原因[1-2]。近年来针对肺腺癌的治疗手段日益增多,但迄今为止,含铂化疗仍是肺腺癌患者最重要的治疗手段之一。因此,寻找能提高化疗有效率的新药物是很值得期待及研究的。

双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是一种青蒿素的衍生物,已被证明具有强力的抗癌活性,能诱导细胞凋亡且无明显不良反应,因此应用于临床已有多年[3-4]。近年研究表明,青蒿素、青蒿琥酯和DHA 在一些化疗出现多重耐药的肿瘤细胞株中均已经展现出强力的抗癌活性[5]。据报道,DHA 能增强人类卵巢癌细胞对卡铂的敏感性[3]。DHA 通过含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)相关的凋亡通路,能够增强白藓碱诱导侵袭性肺腺癌A549 细胞的凋亡[6]。DHA 对胰腺癌、白血病、骨肉瘤及肺癌细胞均展现出显著的抗癌活性[7]。本研究旨在探讨DHA 联合顺铂(cisplatinum,Cis)对H1299 肺腺癌细胞增殖的影响及Caspase家族相关下游凋亡蛋白Caspase-6、Lamin A/C的表达情况。

1 材料及方法

1.1材料 人肺腺癌H1299细胞由解放军总医院王平老师惠赠。细胞在含10%胎牛血清及青链霉素的RPMI 1640培养基中培养,细胞培养箱的条件是5%CO2、37℃。

1.2药品与试剂 DHA 购自重庆华立药业股份有限公司,溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)配成浓度为100 mmol/L 的存储液;Cis购自齐鲁药业有限公司。青链霉素、DMSO、赫斯特(Hoechst)33258、Annexin-V 和碘化丙啶购自美国Sigma公司。RPMI 1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco 公司。Caspase-6、Lamin A/C一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国CST公司。

1.3试验方法及指标 本研究将人肺腺癌H1299细胞按处理药物不同分为4组,分别为：双氢青蒿素组;顺铂组;双氢青蒿素+顺铂组;对照组。

1.3.1肿瘤细胞抑制率 采用MTT 试验评价DHA 与Cis单用及联用对H1299 细胞增殖的影响。将H1299细胞稀释成密度为3×104个细胞/ml的细胞悬液,按每孔100μl铺96 孔板并孵育过夜。将倍比稀释的DHA 及Cis分别或联合加入培养基(DHA 的浓度分别为：2.5、5、10、20、40和80 μmol/L;Cis的浓度分别为1.56、3.12、6.25、12.5、25 和50μmol/L)。将96 孔板置于二氧化碳孵箱中分别孵育24 h 和48 h 后加入MTT 工作液(5 g/L)20μl,继续培养4 h,弃去上清,加入DMSO 震荡溶解甲瓒结晶。用酶标仪在490 nm 波长下检测吸光度(optical density,OD)值,计算药物处理后对细胞生长的抑制率=1-(实验组OD 值/对照组OD 值)×100%,使用Calcusyn软件来计算药物的半数抑制浓度(50%inhibition concentration,IC50)并评价联合用药的抗增殖作用。

本研究采用中效原理(Chou-Talalay联合指数法)观察联合指数的评价[8]。联合指数的计算方程式为：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+[(Dx)1/(Dx)2]/[(D)1+(D)2]。分子的(D)1、(D)2分别代表联合抑制x%时药物1和药物2的浓度。分母的(Dx)1、(Dx)2分别代表单药抑制x%时药物1和药物2的浓度。CI值＜1、=1 和＞1分别代表协同作用、累加作用和拮抗作用。2种药物联合应用抗恶性肿瘤细胞的CI值计算通过Calcusyn软件完成。

1.3.233258 染色 根据Hoechst 33258 试剂说明对各组细胞核进行染色,染色结束后用倒置荧光显微镜观察及拍照。

1.3.3流式细胞术 将H1299细胞按3×105/孔,铺6孔板孵育过夜,按不同组别加入处理药物孵育48 h。收集细胞并用PBS 清洗细胞离心后加入100μl Annexin V结合缓冲液、5 μl Annexin VFITC和10μl碘化丙啶。孵育细胞15 min后再次加入结合缓冲液400μl并吹散细胞,最后用流式细胞仪分析染色后的细胞分布情况。

1.3.4蛋白质印迹法(Western blot) 采用Western blot分析从不同处理组的细胞中提取的凋亡相关蛋白的表达。按不同分组分别处理细胞48 h后收集细胞,PBS清洗离心后在冰上加入RIPA 裂解液震荡裂解30 min。离心并吸取含总蛋白的上清,煮沸变性后加入5×SDS-PAGE上样缓冲液备用。采用BCA 试剂盒进行蛋白定量,获得不同样本上样剂量。等量待测蛋白及蛋白标记物分别加入各孔中,在10% 浓缩胶中80 V 电压下电泳20 min,12%分离胶中120 V 电压下电泳50 min。然后转移到PVDF 膜上,用5%脱脂奶粉进行封闭。TBST 洗膜后用按说明稀释后的一抗4℃冰箱孵育过夜,再次用TBST 洗膜后用稀释完成的二抗室温下孵育1 h。目标蛋白条带位置加上发光液后在暗室中使用胶片曝光、洗片,胶片扫描入电脑进行分析。

1.4统计学分析 采用统计软件SPSS 22.0进行数据的统计与分析。数据以±s表示。百分比数值采用Kruskal-WallisH非参数检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1DHA 联合Cis组对H1299细胞的增殖抑制率高于单药组 将不同浓度的DHA、Cis及DHA+Cis加入H1299培养基中。结果表明联合用药组对H1299细胞的增殖抑制率明显高于单药组(P＜0.01),单药组对细胞的抑制率高于对照组(P＜0.01),见图1。

图1 MTT 试验各组细胞抑制率

2.2DHA 联合Cis产生协同抑制H1299细胞的作用 通过MTT 试验计算不同浓度DHA(2.5～80μmol/L)、Cis(1.56～50μmol/L)及联合用药处理48 h后对H1299细胞增殖的影响,重复3次。通过中效原理使用Calcusyn软件计算2种药物的联合指数(CI值)均小于1.0,表示联合用药具有明显的协同作用(表1)。

表1 DHA 联合Cis作用于H1299细胞不同浓度配比的联合指数

2.3DHA 联合Cis对H1299细胞产生促凋亡作用 对不同处理组的H1299 细胞进行Hoechst 33258染色,通过荧光显微镜观察细胞核的形态变化。DHA 联合Cis作用于H1299细胞后细胞核呈现出典型的凋亡形态学表现-染色质聚集、核皱缩以及核碎裂。另外,通过流式细胞术分析不同处理组间H1299细胞的凋亡情况(图2)。在细胞早期凋亡阶段,凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸外翻并可与染色剂Annexin-V 结合。而在凋亡后期,由于细胞膜完整性的破坏,核染色剂碘化丙啶能穿透细胞膜将细胞核染色。结果显示凋亡细胞百分率分别为9.09%(对照组)、17.07%(DHA 20μmol/L 处理24 h)、17.29%(Cis 12.5μmol/L处理24 h)、25.09%(DHA 20μmol/L+Cis 12.5μmol/L 处理24 h),见图3。

图2 赫斯特33258染色试验各组细胞核形态 SP ×400 A：对照组;B：双氢青蒿素20μmol/L 处理24 h;C：双氢青蒿素20μmol/L+顺铂12.5μmol/L处理24 h

2.4Western blot检测各处理组Caspase家族凋亡靶蛋白Caspase-6、Lamin A/C 的表达情况 通过目标蛋白条带可以看出联合用药组Caspase-6及Lamin A/C的活性片段的表达均高于单药组,单药组高于对照组(图4)。

3 讨论

近些年,传统中药提取物在肿瘤治疗中的研究日益受到重视[9]。DHA 是一种青蒿素的衍生物,近些年它的抗癌活性正在被全世界广泛研究。研究表明DHA 可以通过促进肿瘤细胞凋亡,通过Fe2+介导的直接杀伤作用,抑制肿瘤血管生成等机制达到抗肿瘤作用[10]。因此本研究选择了DHA及Cis作用于人类非小细胞肺癌H1299细胞株单药及联合用药抗肿瘤的效果并对Caspase-6 和Lamin A/C表达进行分析。

图3 流式细胞术检测各组凋亡细胞百分比 A：对照组;B：双氢青蒿素组;C：顺铂组;D：双氢青蒿素+顺铂组

图4 蛋白质印迹法检测各组凋亡相关蛋白表达情况 A：Lamin A/C 的活性片段Cleaved Lamin A/C 的表达;B：Caspase-6的活性片段Cleaved-Caspase-6的表达

据报道,DHA 与许多其他的抗癌药物联用都有较好的协同作用[6,11-12],本研究结果显示：DHA联合Cis组对H1299细胞的抑制率明显高于单药组。另外,本研究通过DHA 与Cis不同浓度配比下作用于H1299细胞48 h后的细胞抑制率,计算了两药联合的CI值,其结果均小于1.0。进一步证明了DHA 联合Cis抑制人类肺腺癌H1299细胞增殖具有明显的协同作用。

细胞凋亡是由细胞内死亡程序活化而引发的细胞的主动死亡[13],其形态学表现主要包括染色质的凝聚、边集以及细胞核皱缩、碎裂等。本研究中Hoechst 33258细胞核染色的结果显示双氢青蒿素联合顺铂可以引起肺腺癌H1299细胞凋亡。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族的多个成员,参与细胞的增值、迁移及细胞免疫,同时参与调解细胞的凋亡[14]。Caspase-6已经被证实在执行细胞凋亡的过程中有很大的贡献[15]。Caspase-6平时以无活性的形式存在,当凋亡信号刺激它是,裂解为具有促凋亡活性的Cleaved-Caspase-6,从而使细胞凋亡[16]。

Lamin A/C是维持细胞核形态的关键蛋白[17]。并参与DNA的复制和转录。当凋亡启动时,Lamin A/C可作为Caspase-6活化片段的特异性底物被裂解为2 个相对分子质量分别为47 000和37 000的活性片段[18-19]。二者的活性片段能使细胞核功能失调并共同促进细胞凋亡[20]。本研究发现DHA 联合Cis 组与单药组相比能显著提高Caspase-6及Lamin A/C活性片段的表达,具有更强的促凋亡作用,这与早前的研究结果相符。

本研究表明DHA 联合Cis能诱导人类肺腺癌H1299细胞的凋亡并具有协同作用。DHA 能增强Cis对H1299的抗癌活性,这与之前的报道结果类似[21]。Caspase家族下游凋亡执行蛋白Caspase-6及Lamin A/C 活性片段的高表达,揭示了其与DHA 联合Cis引起H1299细胞凋亡存在关联,可能与激活了Caspase家族相关的凋亡通路,引起肿瘤细胞凋亡、抑制细胞增殖有关。这为进一步研究DHA 联合Cis用于人类非小细胞肺癌的治疗提供了有用的信息和理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突