一种具有G418抗性筛选标记的慢病毒RNA干扰表达载体的构建及应用

赵思捷，朱文琦，孙杰，侯俊，王友亮，李永利，李波，鲍春梅，张浩，李伯安

1. 解放军总医院第五医学中心 临床检验医学中心，北京100039；2. 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100071

随着人类基因组计划的完成，阐明候选基因在个体发育、遗传变异、肿瘤等重大疾病发生过程中的作用成为研究的重点，通过向特定细胞或组织递送调控候选基因表达的载体来改变其表达水平并检测后续信号通路或生物性状的改变，是研究候选基因功能的一种重要手段。表达载体既可以以质粒的形式转染细胞，也可以通过包装成假病毒的形式感染目的细胞。一些细胞如原代细胞、干细胞、非分裂期的细胞以及分化的细胞用常规的转染方法效率比较低，而将含有病毒包装元件的表达载体包装成病毒后再感染目的细胞可以克服上述困难，因而成为基因功能研究的更有效、更通用的方法[1-2]。

常见的病毒载体有逆转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒载体，它们可以和辅助包装质粒在包装细胞中包装成复制缺陷的假病毒，有效感染靶细胞。但是，逆转录病毒载体只能感染分裂的细胞[3-4]，而腺病毒载体不能整合入宿主的基因组DNA 因而不能实现对目的基因的长久持续性调控[5-6]，因此慢病毒表达载体成为实验室有效的常规研究工具[7-10]。慢病毒载体有基因过表达载体以及将特定基因表达水平敲低的载体（包括RNA干扰载体和基因编辑CRISPR/Cas9 载体等），它们大多含有嘌呤霉素筛选标记基因，可以筛选出基因组中整合有表达载体序列的细胞。但在实验中为排除RNA 干扰序列的非靶效应，经常需要先在细胞中敲低某一基因的表达，随后再进行回复突变进行功能验证；或者在细胞中先将目的基因过表达后再进行RNA 干扰实验进行功能确证，这往往需要过表达载体与敲低载体有2 种不同的抗生素筛选标记基因[11-13]。

本研究中，我们对RNA 干扰载体pLKO-puro进行了改构，首先在该载体骨架中切除嘌呤霉素抗性基因编码片段，然后从pcDNA3.0 载体中扩增新霉素抗性基因并插入酶切后的载体片段中，并将改构的RNA 干扰载体包装成慢病毒后感染肝癌细胞HepG2，检测感染细胞对G418 的抵抗作用。为验证改构RNA 干扰载体的有效性，设计了2 条针对乙型肝炎病毒x基因（hepatitis B virusxgene，HBx）的RNA 干扰序列以及针对萤光素酶cDNA 的对照干扰序列并插入该载体，将含G418筛选标记的HBx 的RNA 干扰载体与辅助质粒在293T 细胞中包装成慢病毒，感染过表达HBx 的HepG2（嘌呤霉素抗性）细胞，G418 筛选出稳定混合克隆，提取细胞总RNA，用RT-qPCR 方法检测其在HepG2 细胞中对HBx RNA 表达的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料

过表达HBx 蛋白的人肝癌细胞系HepG2-X由本中心实验室建立；人胚胎肾细胞293T，质粒pcDNA3.0、pLKO-puro 及慢病毒包装质粒psAX2、pMD2G 由本中心实验室保存；含HBx cDNA 编码序列的质粒pADR 由军事医学研究院生物工程研究所王友亮研究员馈赠；ExTaq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、KpnⅠ和BamHⅠ限制性内切酶、反转录回收试剂盒购自大连宝生物公司；胎牛血清购 自BIOWEST 公 司；DMEM 购 自Hyclone 公 司；G418 购自Amresco 公司；PCR 产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒为天根生化有限公司产品；定量PCR 反应试剂盒为Genstar 公司产品；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 pLKO-neo 的构建

首先从pcDNA3.0 载体中扩增G418 抗性基因DNA 片段，上游引物为5'-CGCGGATCCACCGGA GCTTACCATGATTGAACAAGATGGATTGC-3',下游引物为5'-TTCGGTCGGGCGCTGCGGGTCGTGGGGCGGGCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3'（下游引物序列中含有原载体pLKO-puro 部分骨架序列）；接着以上述PCR 产物为模板，用上述上游引物和下游引物5'-CGGGGTACCGATGCATGGGGT CGTGCGCTCCTTTCGGTCGGGCGCTGC-3'进行第2轮PCR 扩增，通过第2 轮PCR 在新霉素抗性基因终止密码子和KpnⅠ酶切位点中间补充全部的原载体骨架序列。PCR 产物用BamHⅠ/KpnⅠ双酶切并纯化；pLKO-puro 载体也进行相同的双酶切，酶切后回收载体片段并与上述PCR 酶切片段连接，转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR 筛选阳性克隆，提取质粒进行双酶切分析和DNA 测序。

1.3 慢病毒的包装及感染

参见文献[14]。

1.4 萤光素酶shRNA 和HBx shRNA 的设计及克隆

在线设计短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）（www.protocol-online.org），选择分值较高的序列，插入如下下划线的对应模块序列中，将合成后的引物退火后，与经AgeⅠ/EcoRⅠ双酶切的pLKO-neo 连接，转化大肠杆菌DH5α后提取质粒进行测序分析。

下划线序列为引物合成模块的固定序列，合成不同靶位点的shRNA 序列时，只须将21 bp 的靶序列及其互补序列分别插入未划线部分即可。

1.5 RT-qPCR 检测HBx mRNA 在肝癌细胞中的表达水平

用TRIzol 法分别提取稳定表达对照萤光素酶shRNA 以 及2 条HBx shRNA 的HepG2细胞的总RNA，取0.5 μg 反转录为cDNA 并稀释至1/5 后，进行实时荧光定量PCR 检测。用于检测HBx 的正向引物为5'-CAGCAATGTCAACGACCGAC-3'，反向引物为5'-ATGCCTACAGCCTCCCAGTA-3'；用于检测β-actin 的正向引物为5'-CATGTACGTT GCTATCCAGGC-3'，反向引物为5'-CTCCTTAAT GTCACGCACGAT-3'。通过各自的Ct 值计算出HBx 敲低后其mRNA 在细胞内的相对表达量。

2 结果

2.1 pLKO-neo shRNA 表达载体的构建

首先以pcDNA3.0 载体为模板，根据新霉素基因DNA 编码序列扩增出840 bp 的DNA 片段，同时为保持改构后的载体与原载体骨架序列的一致性，又根据pLKO-puro 载体中嘌呤霉素编码区下游和KpnⅠ识别序列上游的载体DNA 序列，将第1 轮PCR 产物进行新一轮PCR 重叠延伸反应，扩增出870 bp 的DNA 片段（图1A），最终PCR 产物纯化后，用BamHⅠ/KpnⅠ双酶切并纯化；将pLKO-puro 载体进行相同的双酶切，酶切后回收8.2 kb 的载体片段并与上述PCR 酶切片段连接，转化大肠杆菌DH5α，菌液PCR 筛选阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定（图1B），pLKO-puro 载体经BamHⅠ/KpnⅠ双酶切后得到8.2 kb 的载体片段和670 bp 的嘌呤霉素抗性基因片段，改构后的pLKO-neo 载体经BamHⅠ/KpnⅠ双酶切后分别得到8.2 kb 的载体片段和900 bp 左右的新霉素抗性基因片段，提示载体已得到成功改构，进一步进行DNA 测序发现双酶切鉴定正确的重组质粒中含有编码完整新霉素抗性基因（结果略）。

2.2 感染pLKO-neo 表达载体HepG2 对G418 筛选的抗性

HepG2 未感染及感染pLKO-neo 包装的慢病毒后48 h，分别用400、600、800 及1000 g/mL 的G418 处理细胞，显微镜下观察细胞存活状况并照相。未感染组细胞处理8 d 后，所有G418 处理组的细胞均大量死亡，且随着G418 浓度提高，细胞死亡程度依次增加，800 g/mL G418 处理组仍有少量细胞贴壁存活，而1000 g/mL G418 处理组细胞全部死亡，见不到贴壁且为上皮状形态的细胞。感染pLKO-neo 包装的慢病毒组细胞在G418处理后虽有细胞死亡，但仍有大量细胞贴壁存活并增殖，至G418 处理后的第8 d，抵抗高浓度（800 和1000 g/mL）G418 的细胞混合克隆均生长至铺满细胞培养板，表明克隆入慢病毒表达载体的新霉素抗性基因在感染细胞中得到了表达且具有对G418 的抵抗作用，提示构建的重组载体pLKO-neo 包装为慢病毒感染细胞后可用于快速、高效筛选出G418 抗性的细胞克隆。

2.3 对照萤光素酶shRNA 及HBx shRNA 的表达

为进一步探索改构载体在RNA 干扰中的应用价值，设计了针对HBx 蛋白编码区的21 bp 的2条RNA 干扰序列，同时设计了1 条针对萤光素酶的RNA 干扰序列，按照pLKO RNA 干扰序列的合成模块合成（参见材料与方法）。将其与互补链退火后，与经AgeⅠ/EcoRⅠ双酶切的pLKO-neo 连接，转化大肠杆菌DH5α后提取质粒测序，结果表明所设计的RNA 干扰序列均正确克隆入载体pLKO-neo 中（结果略）。

2.4 HBx shRNA 序列对HBx 表达的抑制作用

为检测设计的HBx shRNA 对HBx 表达的抑制效果，首先在293T 细胞中将含有萤光素酶及HBx shRNA 序列的慢病毒表达载体pLKO-neo 包装成慢病毒，在稳定过表达HBx 的人肝癌HepG2-X 细胞中分别感染上述3 种慢病毒，同时设1 孔未感染细胞做对照，经G418 筛选1 周后对照细胞全部死亡，而感染组有大量存活细胞，G418 抗性细胞继续生长、传代后，分别提取细胞总RNA 进行RT-qPCR 反应，结果见图3，与稳定表达萤光素酶shRNA 的对照组细胞相比，稳定表达HBx shRNA的感染组细胞中HBx mRNA 水平均显著降低。

图1 pLKO-neo 载体的构建

3 讨论

本研究构建了带有G418 筛选标记的RNA 干扰慢病毒表达载体，经慢病毒包装并感染肝癌细胞后，用合适浓度的G418 筛选获得基因组稳定整合该载体的细胞株；将针对HBx 编码序列的RNA干扰序列插入该载体，将其包装成慢病毒导入高表达HBx 的肝癌细胞HepG2-X 中，能显著降低HBx mRNA 的表达水平。这表明该载体可与具有嘌呤霉素筛选标记基因过表达载体联合使用:可以先建立候选基因稳定高表达的细胞株，再运用该载体降低候选基因mRNA 表达水平；也可以先用该载体抑制候选基因的表达，再进行回复突变功能分析以确证候选基因功能。由于慢病毒感染效率高，感染后载体可整合到靶细胞中，应用G418 筛选，1 周后即可获得稳定表达目的基因shRNA 的细胞克隆。

图2 感染pLKO-neo 载体包装的慢病毒的HepG2 细胞对G418 的抵抗作用

图3 HBx shRNA 对HBx mRNA 表达的抑制作用

在用抗生素筛选外源载体稳定整合细胞的过程中，如已经获得具有嘌呤霉素抗性细胞，再筛选G418 抗性细胞时，2 种抗生素联合使用会造成慢病毒感染组细胞的大量死亡，很难获得稳定的感染细胞。此时，可先不用嘌呤霉素而仅用合适浓度的G418 处理细胞（不同细胞对G418 的敏感性不同，正式筛选稳定细胞克隆之前须先用不同浓度的G418 处理细胞，找出在8 d 左右导致所有细胞死亡的最低浓度作为合适的筛选浓度），待筛选出抗G418 稳定克隆后再补加嘌呤霉素处理，以维持具有2 种抗生素抗性细胞的生长。

大量研究表明HBx 在肝癌发生中通过影响细胞的增殖、转移及肿瘤微环境的改变而发挥重要作用[15-16]，HBx 也能通过肿瘤细胞抑制机体免疫功能，但相关研究较少[17]。本研究在肝癌细胞中分别建立了HBx 过表达以及在HBx 过表达后敲低其表达的稳定细胞系，为深入探讨HBx 调节宿主免疫功能奠定了基础。