基于数据挖掘分析microRNAs在冠状动脉支架内再狭窄中的调控机制

尹培永，崔小红，熊婷，何喜民

海南省三亚市 中医院，海南 三亚572000

经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是冠心病患者再血管化的主要手段。然而PCI 治疗在使患者获益的同时，也会带来支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）等新的风险。虽然药物洗脱支架的使用已经大大降低了ISR 的发生，但目前ISR 仍有5%～10%的发生率[1-3]。因此，如何有效防治ISR 一直是冠脉介入治疗领域的一大难题。microRNAs（miRNAs）是一类长约22 个碱基的非编码小分子单链RNA，通常在转录后水平抑制基因表达[4]。miRNAs 在心血管疾病的发生、发展中具有重要的调控作用。研究表明，miRNAs 可作为预测ISR 的标志物，还可以作为ISR 治疗靶点，但miRNAs 在ISR中的作用及机制远未完全阐明[5]。为了进一步系统揭示miRNAs 在ISR 中的调控作用及机制，我们利用GEO 数据库中的芯片数据，分析了ISR 中的差异表达miRNAs 及其作用靶基因，希望能够为ISR 的防治提供新的线索和思路。

1 资料与方法

1.1 miRNAs芯片数据来源和再分析

由NCBI 公共数据平台GEO（Gene Expression Omnibus）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载miRNAs 芯片数据GSE60959[6]。芯片平台是Illumina 公司的GPL8179，版本为Illumina Human v2 microRNA expression beadchip。GSE60959 数据集包含6 例ISR 患者（试验组）和4 例非ISR 健康对照者（对照组）。接受药物涂层支架植入的急性心肌梗死或病变血管完全闭塞的冠心病患者，术后6～12 个月随访，行经状动脉造影检查。造影显示植入支架血管直径狭窄程度≥50%者定义为ISR，入选为试验组。对照组为健康志愿者。2 组在性别、年龄、吸烟史、身体质量指数（body mass index，BMI）、高血压/糖尿病病史方面无明显差异。该研究是对GEO 数据库下载数据的生物信息学再分析，未进行人体或动物实验，因此不涉及伦理及知情同意书事项。

将原始芯片数据（CEL files）导入GeneSpringGX 软件进行再处理，首先可以得到主成分分析结果，用来展示2 组间miRNAs 整体表达情况是否存在差异；进一步采用非配对t检验和Benjamini-Hochberg 错误发现率校正法筛选2 组间差异表达miRNAs，同时满足差异倍数＞5 和P＜0.01 的miRNAs 为最终差异表达miRNAs，结果以火山图形式展示。

1.2 miRNAs靶基因的生物信息学预测

采用miRNAs 靶基因预测算法TargetScan（www.targetscan.org/）和miRanda（mirracle.igib.res.in/miracle/），预测ISR 组和对照组之间差异表达循环miRNAs 的靶基因，同时被2 个预测软件预测得到的靶基因纳入下一步信号通路富集分析。

1.3 基于miRNAs-靶基因的KEGG信号通路富集分析

将预测得到的miRNAs 靶基因输入DAVID 平台（https://david-d.ncifcrf.gov/），经由KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行信号通路富集分析，得到靶基因主要参与的信号通路。miRNAs 与其靶向信号通路的网络调控关系由Cytoscape 3.0.0 beta 1（www.cytoscape.org）实现可视化。

1.4 差异表达miRNAs靶基因的验证

由GEO 公共数据平台下载另一个mRNAs 芯片数据GSE46560，芯片平台是Affymetrix 公司的GPL15207，版本为［PrimeView］Affymetrix Human Gene Expression Array。该数据包括5 例ISR 患者和6 例非ISR 患者。经GeneSpringGX 软件分析，得到2 组间差异表达mRNAs，差异靶基因的设置参数为差异倍数＞1.5 和P＜0.01。将这些mRNAs与miRNAs 预测靶基因取交集，得到miRNAs 调控ISR 所作用的潜在基因。

2 结果

2.1 ISR组与对照组差异表达miRNAs

经GeneSpringGX 软件对芯片数据GSE60959再分析，发现2 组间miRNAs 表达有明显不同（图1A）。与对照组相比，ISR 组存在131 个差异表达循 环miRNAs，其中上调41 个，下 调90 个（图1B）。前5 个上调miRNAs 见表1。

表1 前5个上调miRNAs

2.2 差异表达miRNAs靶向信号通路富集分析

为了解上述差异表达miRNAs 在ISR 中的潜在作用，我们对前5 个miRNAs 的靶基因进行预测分析，通过TargetScan 和miRanda 预测算法将靶基因取交集后，共得到6587 个基因。随后将这些基因输入DAVID 平台，经由KEGG 数据库得到这些miRNAs 靶向的信号通路。Cytoscape 软件构建的共表达网络分析显示，hsa-miR-512 靶向信号通路最多（图2）。其中同时被3 个及以上miRNAs靶向的信号通路及参与基因见表2，这些信号通路主要包括MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Wnt signaling pathway、Focal adhesion、Neurotrophin signaling pathway 和Regulation of actin cytoskeleton。

图1 ISR 组与对照组循环miRNAs 差异表达谱

2.3 ISR相关mRNAs芯片数据中验证miRNAs靶基因

用GeneSpringGX 软件对mRNAs 芯片数据GSE46560 进行再分析，结果表明ISR 组与非ISR组间的mRNAs 表达谱存在差异。与非ISR 组相比，ISR 组有171 个差异表达mRNAs，其中下调106 个。将106 个下调mRNAs 与5 个上调最明显的miRNAs 的6587 个靶基因取交集，最后得到43个受miRNAs 抑制的潜在靶基因（图3）。用Cytoscape 构建5 个miRNAs 与43 个下调靶基因的共表达网络，显示miR-512 抑制的靶基因最多（图4）。

表2 同时被3个及以上miRNAs靶向的信号通路及参与基因

图2 ISR 患者中前5 个上调最明显循环miRNAs 靶向的信号通路

图3 验证ISR 患者中前5 个上调循环miRNAs 靶基因的分析流程

3 讨论

本研究中，我们在GEO 数据库中筛选到ISR患者的miRNAs 和mRNAs 芯片数据，通过对2 部分数据的再分析，发现了在ISR 中上调最明显的5个miRNAs 及其作用的信号通路和43 个潜在靶基因，并构建了miRNAs 在ISR 中的信号通路调控网络及其与靶基因的共表达网络，阐释了miRNAs在ISR 调控作用及潜在机制。

ISR 发生机制非常复杂，其中内皮损伤、炎症细胞招募和激活，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和迁移（即由静态的“收缩”表型转向增殖的“合成”表型），导致新生内膜过度增生，是ISR 的共同特征和基本机制[7]。研究表明，miRNAs 在血管损伤所致的上述病理改变中具有重要调控作用。miR-92a 在内皮细胞中含量丰富，血管损伤后其表达显著增高，抑制miR-92a 水平后，可以加速再内皮化、抑制炎症反应，且不影响VSMCs 的功能，最终使内膜新生及ISR 被抑制[8-9]。miR-21 通过促进VSMCs 增殖，促进内膜新生，抑制miR-21 可以降低猪和小鼠的ISR[10]。特别是有研究发现，miR-221/222 在血管内皮细胞和VSMCs 中具有相反的生物学作用，拮抗miR-221/222 后，既可促进内皮细胞增殖，加速再内皮化，又可抑制VSMCs 增殖和迁移，减轻内膜增生[11]。由此可见，miRNAs 是防治 ISR的重要靶点。

图4 ISR 患者中前5 个上调循环miRNAs 与ISR 患者中43 个下调靶循环mRNAs 的共表达网络

本研究选取ISR 患者循环中上调最明显的前5 个差异表达miRNAs，进行靶基因预测及KEGG信号通路富集分析，发现这些miRNAs 主要靶向的信号通路包括MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway、Wnt signaling pathway、Focal adhesion、Neurotrophin signaling pathway、Regulation of actin cytoskeleton 和mTOR signaling pathway，这些信号通路涉及细胞增殖、迁移、黏附等，均与ISR 病理过程密切相关。为了进一步确定5个差异表达miRNAs 的作用靶点，我们分析了另一组ISR 患者的差异循环mRNAs，然后将预测得到的miRNAs 靶基因与该芯片中的下调基因取交集，最终发现43 个共有基因。其中，hsa-miR-512靶向的基因及信号通路均最多，提示miR-512 在ISR 中具有重要的调控作用。

综上，本研究系统揭示了miRNAs 在ISR 中的调控作用，为ISR 的发生机制及预防研究提供了理论依据，这些ISR 循环中差异表达miRNAs 的确切作用可通过生物学实验进一步验证。