人类复制因子C4在肺腺癌进展中的初步功能探究

祁昕，齐书山，吴鹏涛

北京市房山区良乡医院 胸心血管外科，北京102400

肺癌位列全球癌症相关死亡原因之首[1]，其中约85%的肺癌被归类为非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC），其被细分为鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞癌。肺腺癌是最常见的肺癌亚类，占NSCLC 病例的65%，占所有肺癌的40%以上[2]。因此，了解肺腺癌的致癌信号传导机制，确定治疗该疾病的新治疗靶点很有必要。

研究证实，肺腺癌的发生与体内一些基因（包括癌基因、抑癌基因等）的突变有关[3-8]。人类复制因子C 第四大亚基（human replication factor C subunit 4，RFC4）在DNA 合成和DNA 损伤后的DNA 修复活动中发挥重要作用[9-10]。据报道，该基因在多种恶性肿瘤，如前列腺癌、宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌和肝癌中表达失调[11-16]。然而，RFC4 在肺癌发生和发展中的作用仍不清楚。在本研究中，我们探讨了RFC4 在肺腺癌中的表达水平，并确定了RFC4 在肺腺癌中的潜在生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺腺癌细胞系A549、H1437，人正常肺上皮细胞BEAS-2B 购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；RFC4 抗体、β-actin 抗体和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自Abcam 公司；逆转录试剂盒和SYBR Green 染料购自TaKa-Ra 公司；10%胎牛血清、RPMI1640 培养基购自Hyclone 公 司；LipofectAMINE RNAiMAX Reagent试剂盒购自Thermo Fisher Scientific 公司；TRIzol试剂购自Invitrogen 公司；Matrigel 基质胶购自BD公司；Transwell 小室购自Corning 公司。

1.2 数据挖掘分析

通过starBase Pan-Cancer 分析平台（http://starbase.sysu.edu.cn/panCancer.php）分析从癌症基因组图谱（TCGA）获取的RFC4 在肺腺癌组织中的表达数据；通过Kaplan-Meier plotter 分析平台（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background）分析RFC4 基因与肺腺癌生存预后的关系。

1.3 细胞培养及转染

细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，在37℃含5% CO2的细胞恒温培养箱中培养。使用LipofectAMINE RNAiMAX Reagent 试剂盒转染细胞系，敲低RFC4 的表达。siRNA 序列为RFC4 siRNA sense（5'-GACCAAGGAUCGAGGAGUAdTd T-3'）和RFC4 siRNA antisense（3'-dTdTCUGGUU CCUAGCUCCUCAU-5'）。

1.4 RNA提取和qRT-PCR

用TRIzol 试剂盒提取总RNA，PrimeScript RT试剂盒反转录RNA，用ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR System 检测仪和SYBR Green qPCR试剂盒进行荧光定量PCR。以β-actin 为标准化内参，2-ΔΔCt法分析数据。RFC4 正向引物为5'-TT GTATCGCGGAAACCTGAGGAAC-3'，反向引物为5'-ACTGGCAGCTACTCCTCGATCCTT-3'；β-actin正向引物为5'-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA-3'，反向引物为5'-TCGGCCACATTGTGAACTTT-3'。

1.5 蛋白质免疫印迹

提取细胞总蛋白，10% SDS-PAGE 电泳分离蛋白，用电转仪将胶上蛋白转至PVDF 膜，用含5%脱脂奶粉的PBST 溶液封闭膜后，将膜与抗体孵育过夜，PBST 清洗后再与二抗孵育，清洗后加入化学显色液，放至凝胶成像仪中观察。

1.6 CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期细胞制成悬液，以1×105/孔接种于96 孔板，分别在1、2、3 和4 d 进行CCK-8 检测，通过酶标仪测定D450nm值，D450nm值与活细胞数量成正比。以时间为横坐标、D450nm值为纵坐标绘制细胞生长图。

1.7 Transwell法检测细胞迁移

取对数生长期细胞制成悬液，调整细胞浓度为2×105/mL。在下室加入600 μL 含10%血清的培养基，上室加入150 μL 细胞悬液，每种细胞种3 个小室，培养24 h 后取出小室，擦去小室内表面未穿膜的细胞，甲醇固定15 min，DPAI 染核10 min，PBS 清洗后，在荧光显微镜下观察视野并统计结果。

1.8 Transwell法检测细胞侵袭

将冻存的Matrigel 基质胶于4℃放置至液态，与无血清培养基以5∶1 混匀，每个小室加入100 μL 混合液，在37℃培养箱中孵育5 h。其余步骤同细胞迁移实验。

1.9 数据统计分析

用GraphPad Prism 6 进行统计学分析。计量数据以为x±s表示，组间数据采用t检验和方差分析，两两多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RFC4在肺腺腺癌组织中的表达

starBase 分析526 例肺腺癌组织和59 例正常对照组织结果显示（图1），RFC4 在肺腺癌组织中的表达量显著高于正常对照组织（P＜0.05），说明RFC4 在肺腺癌组织中高表达。

图1 starBase 分析TCGA 中RFC4 在肺腺癌组织中的表达

2.2 RFC4表达与肺腺癌预后的关系

利用Kaplan-Meier plotter 分析RFC4 表达与肺腺癌预后的相关性，结果见图2，高水平的RFC4 表达与不良总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）显著相关（P分别为0.0018、0.021），RFC4表达越高，患者的OS 和RFS 就越低，预后越差。

图2 RFC4 表达对肺腺癌预后的影响

2.3 RFC4在肺腺癌细胞系中的表达

从图3 可以看出，RFC4 在2 种肺腺癌细胞系A549、H1437 中的mRNA 和蛋白表达水平均明显高于正常肺上皮细胞BEAS-2B（P＜0.05），这与RFC4 在肺腺癌组织中的表达一致。

2.4 RFC4siRNA沉默效率检测

为了进一步研究RFC4 在肺腺癌细胞中的功能，将RFC4 siRNA 分别转染A549 和H1437 细胞，并在mRNA 和蛋白水平检测RFC4 siRNA 的沉默效率，结果见图4。转染siRNA 后，A549 和H1437细胞中的RFC4 mRNA 表达均显著降低（P＜0.05）；同样地，A549 和H1437 细胞中的RFC4 蛋白表达也明显低于对照（P＜0.05）。

2.5 RFC4siRNA对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

肺腺癌细胞转染RFC4 siRNA 后，RFC4 的表达降低（图4），si-RFC4 肺腺癌细胞的增殖活力也明显降低（图5）。同时，随着RFC4 的表达降低，si-RFC4 肺腺癌细胞的迁移和侵袭能力也显著低于对照（图6）。此结果说明，RFC4 的表达对肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭有促进作用。

图3 RFC4 在肺腺癌细胞系中的表达

图4 RFC4 siRNA 转染肺腺癌细胞后RFC4 的表达

图5 RFC4 siRNA 对肺腺癌细胞增殖的影响（*P＜0.05）

图6 RFC4 siRNA 对肺腺癌细胞迁移/侵袭的影响（*P＜0.05）

3 讨论

肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤[1]。肺腺癌是非小细胞肺癌最常见的亚型，每年致50 多万人死亡[17]。虽然目前用于治疗肺癌的靶向药物已经获得了一些进展，但耐药、复发等问题也随着靶向药物的使用而出现，所以探究肺癌的治疗靶点仍十分必要。

RFC4 在真核生物DNA 复制和DNA 损伤修复中发挥重要作用[9-10]。癌细胞无限增殖和易分散转移的生物特性，可能与癌细胞中RFC4 的表达失调有关。先前的研究表明RFC4 在不同癌症中高表达也证明了这一点，如在结直肠癌、肝癌中RFC4 均过度表达[15-16]。在本研究中，RFC4 在肺腺癌组织和细胞中均高表达，并且与肺腺癌预后有较强的相关性，RFC4 表达越高，肺腺癌患者的总生存期和无复发生存期越低，预后较差。这些结果表明RFC4 可能在肺腺癌中发挥致癌作用。

为了进一步研究RFC4 与肺腺癌细胞增殖之间的关系，我们通过RFC4 siRNA 转染肺腺癌细胞，敲低了RFC4 在肺腺癌细胞系中的表达。采用CCK-8 法和Transwell 法检测发现，RFC4 的表达降低使肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著下降，说明RFC4 在肺腺癌细胞增殖进展中发挥着重要的作用。

综上所述，RFC4 在肺腺癌细胞中高表达，且与肺腺癌预后关系密切。RFC4 的表达促进了肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究为开发肺腺癌新的预后标志物提供了研究思路，RFC4 可以作为肺腺癌新的治疗策略的潜在靶标，但涉及的详细分子机制仍须进一步探究。