二甲双胍对人膀胱癌细胞能量代谢的调控作用分析
2019-09-27李慧瑾陈葳
李慧瑾，陈葳
1. 陕西省缺血性心血管疾病重点实验室，西安医学院 基础与转化医学研究所，陕西 西安710021；2. 西安交通大学第一附属医院 检验科，陕西 西安710061
膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，全球范围内每年新增的膀胱癌患者多于33 万例，死亡病例多于3 万例。膀胱癌的发病率有明显的性别差异，男性与女性患者的比例约为3.8∶1[1]。在不同的国家和地区，膀胱癌的发病率不尽相同，其中以西班牙发病率最高。在我国，膀胱癌发病率在泌尿系统中居于首位，且呈逐年上升趋势，严重威胁人类的健康和生命[2-3]。近年来有研究报道，二甲双胍有抑制肿瘤生长的作用[4-7]，但关于二甲双胍在膀胱癌能量代谢方面的作用机制研究较少，作用机制尚未阐明。关于肿瘤细胞的代谢研究最早由Warburg 提出，他发现大多数肿瘤细胞即使在有氧条件下仍选择糖酵解途径为其提供能量和生物合成原料[8]。事实上，肿瘤细胞的代谢平衡调节的复杂程度已远远超出Warburg 当初的设想[9]。肿瘤细胞代谢异常并非由单一的代谢通路简单调控，而是细胞中整个代谢网络的错综复杂的改变，包括糖酵解和线粒体代谢等在内的整个代谢网络的转变。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是糖酵解最后一步的限速酶，参与多种肿瘤细胞的有氧糖酵解[10-11]。HK2可通过N 端结合结构域锚定到电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）蛋白上而定位于线粒体[12]。研究表明，VDAC 和HK2 的结合可通过抑制线粒体通透性转换孔的形成发挥抑制细胞凋亡的功能[13-14]。我们将分析不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤糖酵解和线粒体代谢的作用及其机制，为进一步明确二甲双胍抑制肿瘤的作用机制提供实验和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
人膀胱肿瘤细胞UMUC2 和5637（用含10%胎牛血清的1640 培养基常规培养）由实验室保存；二甲双胍粉末购自北京索莱宝公司；1640 培养基购自Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Fast200 RNA 提取试剂盒购自上海飞捷公司；RNA 反转录试剂盒购自Thermo 公司；SYBR greenⅡ购自TaKaRa 公司；CCK8 检测试剂盒购自上海七海复泰公司；一抗（HK2、VDAC、p-STAT3 和βactin）和HRP 标记的二抗均购自CST 公司；引物由上海生工公司合成。
1.2 葡萄糖检测
按照3×105/孔将细胞接种至6 孔板，在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将培养液收集到EP管中，以初始细胞培养液葡萄糖量作为本底值，消化细胞后计数，检测液为样本0.01 mL 加工作液1 mL。将反应液混匀后37℃水浴15 min，按100 μL/孔加至96 孔板，测定D505nm值。样本中葡萄糖含量=（测定D值-空白D值）×标准品浓度×样本测试前稀释浓度/（标准D值-空白D值）。结果用细胞数进行校正。
1.3 乳酸检测
按照3×105/孔将细胞接种至6 孔板，在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。将培养液收集到EP管中，以初始细胞培养液乳酸量作为本底值，消化细胞后计数，检测液包括样本0.02 mL、酶工作液1 mL、显色液0.2 mL。将反应液混匀后37℃水浴10 min，加入终止液2 mL 混匀，按100 μL/孔加至96 孔板，测定D530nm值。样本中乳酸含量=（测定D值-空白D值）×标准品浓度×样本测试前稀释浓度/（标准D值-空白D值）。结果用细胞数进行校正。
1.4 ATP检测
6 孔板每孔加入200 μL ATP 检测裂解液裂解，4℃、12 000 r/min 离心5 min，收获上清待检测。按照1∶5 的比例用ATP 检测稀释液稀释ATP检测试剂，在检测管中加入20 μL 样品，按每个样品加入100 μL ATP 检测工作液到检测管内，室温避光静置3～5 min，迅速混匀，用Luminometer仪测定RLU 值。为消除细胞数量不同造成的差异，通过BCA 蛋白定量法对样品制备过程中收获的上清中的总蛋白进行浓度测定，将ATP 浓度换成nmol/（L·μg）蛋白的形式定量。
1.5 细胞膜电位检测
用mitoTracker Red CMXRos 红色荧光探针检测细胞膜电位变化。配制1 mmol/L 的mitoTracker Red CMXRos工作液，用94 μL DMSO 溶 解50 μg 粉末即得。将细胞于24 孔板中常规培养，加入二甲双胍48～72 h，细胞汇合度50%左右时加入37℃预热的mitoTracker Red CMXRos 工作液（50 nmol/L），静置孵育30 min；用培养基洗涤细胞2 次，甲醇室温固定15 min；用PBS 洗涤细胞3次，每次2 min；收集细胞，酶标仪测定红色荧光强度。
1.6 RNA提取及real-time PCR
用Fast200 RNA 提取试剂盒提取总RNA，用NanoDrop 测定RNA 浓度。取1 μg RNA，用Revert Aid 第一链cDNA 合成试剂盒反转为cDNA。合成目的基因特异性上下游引物，以cDNA 为模板扩增（扩增条件:95℃ 10 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环），β-actin为内参。VDAC、HK2 和β-actin 的real-time PCR 鉴定引物见表1。
表1 real-time PCR 鉴定引物信息
1.7 Western印迹检测蛋白表达水平
二甲双胍处理细胞后，用RIPA 裂解液裂解细胞（1 mmol/L PMSF，1%蛋白酶鸡尾酒抑制剂），冰上裂解30 min 后离心，上清即为获得的蛋白。用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，进行12% SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白转移至NC 膜（240 mA，1 h），用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h；用VDAC、HK2、磷酸化信号转导与转录激活因子3（phosphorylated signal transduction and activator of transcription 3，p-STAT3）和β-actin 一抗4℃孵育过夜，TBST 洗涤5 次，每次8 min；用HRP 标记的羊抗兔或羊抗鼠的二抗室温孵育1 h，TBST 洗涤5 次，每次8 min；加入ECL 发光液，在化学发光仪上显影，根据条带的强弱比较蛋白表达水平的变化。
1.8 统计学分析
实验数据均用x±s表示，用SPSS18.0 和Graph-PadPrism software version 5.0软件进行分析。2 组之间的差异比较采用两样本t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞葡萄糖消耗的影响
检测不同浓度的二甲双胍对膀胱肿瘤细胞UMUC2 和5637 中葡萄糖消耗的水平，发现当二甲双胍浓度为20 mmol/L 时2 种细胞的葡萄糖浓度最低，随着二甲双胍浓度的升高，细胞培养液中葡萄糖浓度升高。在UMUC2 细胞中，随着二甲双胍浓度升高，葡萄糖升高具有显著性差异，即随着二甲双胍浓度的升高葡萄糖消耗减少。结果见图1。
图1 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞葡萄糖消耗的影响
2.2 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞乳酸水平的影响
检测了不同浓度的二甲双胍对膀胱肿瘤细胞UMUC2 和5637 中乳酸消耗的水平，发现2 种细胞中的乳酸水平保持不变，即随着二甲双胍浓度的升高乳酸消耗无显著变化。结果见图2。
图2 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞乳酸水平的影响
2.3 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞ATP 含量的影响
线粒体是有氧呼吸的主要场所，我们检测了ATP 含量的变化。用不同浓度的二甲双胍处理膀胱肿瘤细胞UMUC2 和5637，发现2 种细胞的ATP含量随着二甲双胍浓度的升高而逐渐下降。结果见图3。
图3 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞ATP 含量的影响
2.4 二甲双胍对膀胱肿瘤细胞线粒体膜电位的影响
为进一步分析不同浓度二甲双胍对人膀胱肿瘤细胞活力调控的机制，我们检测了不同浓度的二甲双胍对UMUC2 和5637 细胞线粒体膜电位的影响。mitoTracker Red CMXRos 可直接聚集在有活性的线粒体上，红色荧光的强度反映线粒体的活性。将二甲双胍加入膀胱肿瘤细胞作用48 h 后，对线粒体活性进行荧光检测。结果显示，20 mmol/L 的二甲双胍能明显降低细胞线粒体的活性，而在40 和60 mmol/L 二甲双胍作用下，细胞线粒体活性相比对照组未见降低反而有升高趋势（图4）。
图4 不同浓度二甲双胍对膀胱肿瘤细胞线粒体膜电位的影响
图5 线粒体相关基因的mRNA（A）和蛋白表达（B）水平
2.5 线粒体相关基因表达
VDAC 的主要作用是保持线粒体外膜通透性，HK2 是糖酵解途径的最终关键酶，并且其表达受STAT3 的调控。我们检测了VDAC 和HK2 的RNA 和蛋白表达水平、p-STAT3 的蛋白表达水平。real-time PCR 结果显示（图5A），相比对照组，不同浓度的二甲双胍处理组的VDAC 和HK2的mRNA 表达水平逐渐下降，其中40 和60 mmol/L 二甲双胍对VDAC 和HK2 的mRNA 表达水平抑制更明显。Western 印迹表明（图5B），加入二甲双胍可明显降低VDAC、p-STAT3 和HK2 的表达，60 mmol/L 二甲双胍的抑制效果最明显。
3 讨论
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。在世界范围内，每年有超过430 000 例新发膀胱癌患者。2018 年仅美国的新发病例为81 890 例，死亡病例为17 240 例[15]。在我国，膀胱癌的发病率居于泌尿系统首位，且呈逐年上升趋势。近年来，虽然膀胱癌通过手术结合放疗和化疗的综合治疗已获得较好控制，但其复发率高且具有肌肉侵袭性特征，导致其治疗效果无法令人满意。因此，积极探究膀胱癌发生发展的分子机制，寻找合理有效的诊断监测标志物及新的治疗靶点，具有重要意义。二甲双胍最早用于降血糖治疗，但近年来研究发现二甲双胍可抑制多种肿瘤进展，但其具体机制尚须阐明。本研究中，我们检测了不同浓度的二甲双胍对膀胱肿瘤细胞的葡萄糖含量、乳糖水平、ATP 水平及细胞膜电位的影响，结果提示二甲双胍可以通过抑制糖酵解和线粒体功能发挥对膀胱肿瘤的抑制作用。为了进一步检测其具体的作用机制，我们检测了HK2、VDAC 和p-STAT3 的表达，结果提示二甲双胍可以通过降低HK2、VDAC 和p-STAT3 的表达来发挥作用。综上所述，本研究提示二甲双胍可能通过抑制HK2、VDAC 和p-STAT3 的表达来阻断膀胱肿瘤的糖酵解和线粒体功能，为研究二甲双胍对肿瘤的抑制作用机制奠定了理论基础并提供了实验依据。
