酿酒酵母W5核酸内切酶基因HO的克隆及生物信息学分析

尹紫良，王长丽，葛菁萍

黑龙江大学a. 农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江 哈尔滨150500；b. 生命科学学院微生物省高校重点实验室，黑龙江 哈尔滨150080

随着酿酒酵母全基因组测序的完成，有关其各种组学的理论研究也已经十分透彻[1]，作为世界上公认的真核模式生物[2]，近年来其应用领域逐渐呈现出多元化，在能源探索[3-5]、学科研究[6-7]、环境保护[8]、食品生产[9-10]及疾病模式探索[11-13]等相关领域不断取得重大进展。

大量研究发现，酿酒酵母在传代过程中普遍存在一种特殊的现象即倍性回复，而倍性的变化会引起基因组的不稳定[14]。通常情况下，酿酒酵母为单倍体或二倍体，自然界中还存在多倍体[15]，其细胞配型由MAT转座子编码的信息决定[16]，研究人员根据MAT基因座遗传信息的差异，将单倍体菌株分为MATa 型（a 型）和MATα型（α型）2 种接合型，而单倍体a 型和α型会与母细胞发生同宗接合形成二倍体[17]。酿酒酵母这种单双倍体相互交替的现象[18]，除了受环境等外界因素的影响外，核酸内切酶HO基因（也称为同宗接合基因）起着决定性的作用，该基因所编码的位点特异性重组酶[19-21]会在MAT交配型位点处产生特异性双链断裂，完成沉默供体位点和活化位点之间的信息转换，导致母细胞（MATa）与子细胞（MATα）之间发生MATa 与MATα的相互转化，从而产生同宗接合或异宗配合现象。异宗配合型菌株的交配型是稳定的，而同宗接合型单倍体菌株由于HO基因的表达，所以其交配型很不稳定[15]。同宗接合现象并非时刻都会发生，研究表明，在外界环境适宜的情况下，单倍体酵母细胞通过芽殖的方式沿母细胞轴向生成子细胞，子细胞则会产生一种参与DNA 修复过 程 的Ash1 蛋白[22]，它 会 抑制HO基因的表达，进而使单倍体菌株不能发生同宗接合形成二倍体细胞。目前，对于酵母核酸内切酶HO基因的研究已经不仅仅局限于酵母传代领域，它还涉及了包括酵母分子水平机制探究在内的诸多方面。

由此可以看出，HO基因在酿酒酵母单倍体的研究中具有非常重要的作用。本研究中，我们以实验室前期筛选得到的一株二倍体酿酒酵母W5（MATa/α）为出发菌株，通过引物设计进行PCR，克隆其HO基因并做相应的生物信息学分析，这为今后对该酵母进行单倍体构建及二倍体回复、探讨HO基因对单倍体的稳定性具有先期的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

酿酒酵母W5（用于基因组提取及目的基因克隆）、大肠杆菌DH5α（用于目的基因克隆转化）均由黑龙江大学微生物重点实验室提供；供试质粒pMD18-T，限制性内切酶SalⅠ、XbaⅠ购自大连（宝）生物工程有限公司；TaqDNA 聚合酶、PfuDNA聚合酶购自Fermentas 公 司；BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit、BioSpinGel Extraction Kit 购自杭州博日科技有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit、TIANquick Midi Purification Kit购自北京天根生化科技有限公司。

LB 培养基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.0，121℃湿热灭菌15 min，用于大肠杆菌DH5α的培养。

YPD 培养基:蛋白胨2 g/L，酵母提取物1 g/L，葡萄糖2 g/L，pH 自然，108℃湿热灭菌20 min，用于酿酒酵母W5 菌株的培养。

改良YPD 培养基:蛋白胨0.3 g/L，酵母提取物0.8 g/L，葡萄糖10 g/L，ZnSO4·7H2O 25 mg/L，pH 自然，108℃湿热灭菌20 min，用于产孢前酿酒酵母W5 菌株的培养。

1.2 引物设计

根据NCBI 中序列号为NC_001136.10 的酿酒酵母S288C 染色体Ⅳ上的HO基因序列，用Primer 5.0 软件设计引物对，用来克隆和扩增酿酒酵母W5 的HO基因序列。上游引物（HO-up）为5'-AGCAGATGCGCGCACCTG-3'。

1.3 酿酒酵母W5基因组DNA的提取及HO基因的克隆与鉴定

用TIANamp Bacteria DNA Kit 提取酿酒酵母W5 基因组DNA，再以获得的基因组DNA 为模板，对HO基因进行PCR 扩增。PCR 反应程序:94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30 次循环；72℃终延伸10 min。PCR 反应体系:dNTP 混合液（2.5 mmol/L）4 μL、酿酒酵母W5 DNA（25 ng/μL）10 μL、Pfu聚合酶缓冲液（添加Mg2+）5 μL、HO-up（1 pmol/μL）5 μL、HO-down（1 pmol/μL）5 μL、PfuDNA 聚合酶（2.5 U/μL）1 μL、ddH2O 20 μL。将扩增产物用TIAN-quick Midi Purification Kit纯化后与pMD18-T 载体相连，通过热激法将连有HO基因片段的T 载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白筛选获得阳性克隆子，菌液PCR 和限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ双酶切验证后送博仕生物技术有限公司测序并命名为pTSW-HO。

1.4 生物信息学分析

利用BLAST 软件对HO基因序列进行ORF Finder 分析及同源性分析；利用DNAMAN 软件对HO基因序列进行翻译，获得相应的蛋白质序列后，对该蛋白质的相对分子质量、理论等电点、氨基酸组成、原子组成、消光系数、半衰期、稳定性指数、脂肪族氨基酸指数、亲（疏）水性的平均值及磷酸化位点进行分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/；https://web.expasy.org/protparam/）；对该基因序列进行RPS-Blast 分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、HO蛋白跨膜区及重复序列分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；http://www.ebi.ac.uk/Radar/）；构建该蛋白质的二、三级结构模型（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html；http://swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1），进行亚细胞定位分析（http://www.psort.org/psortb/index.html）。

2 结果

2.1 酿酒酵母W5基因组DNA提取及目标基因克隆

1.5%琼脂糖凝胶电泳可见在大于15 000 bp处有一条清晰的条带，说明成功地提取了酿酒酵母W5 基因组DNA（图1A）。以酿酒酵母W5 基因组DNA 为模板，PCR 扩增获得的目的条带与预期相符，约为1760 bp（图1B）。BglⅡ/XhoⅠ双酶切验证（图1C）和菌液PCR 验证（图1D）结果与预期相符，说明HO基因克隆成功。

图1 酿酒酵母W5 基因组DNA（A）、HO 基因PCR 产物（B）、质粒pTSW-HO 双酶切产物（C）、菌液HO 基因PCR 产物（D）

2.2 HO基因的生物信息学分析

测序后获得的核苷酸序列长度为1760 bp，利用NCBI 的ORF Finder 程序分析，发现该基因序列拥有一个完整的开放读框，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，编码的蛋白由586 个氨基酸残基构成，预测相对分子质量为66 089.13，理论等电点（pI）为9.32，为碱性蛋白质。根据测序结果登录NCBI，用BLAST 数据库分析酿酒酵母W5 的HO基因序列，结果显示所测序列与酿酒酵母Y169（NCBI:CP033473.1）HO基因序列100%一致，与酿酒酵母YJM1326（NCBI:CP004710.2）HO基因序列有99.94%的一致性，与酿酒酵母Evolution Canyon#3（NCBI:GQ923584.1）HO基因完整的CDS 序列有99.60%的一致性，与克隆载体pHCT2 蛋白完整序列（NCBI:KT725395.1）100%一致，与酿酒酵母HCNKIsf G7 染色体Ⅳ蛋白序列（NCBI:CP008171.1）有99.32%的一致性。比对结果说明，测序所得的核苷酸序列为编码同源转换核酸内切酶的基因序列。

氨基酸组成预测分析表明，酿酒酵母W5HO基因所编码的HO 蛋白序列中Lys 含量较高，达8.9%，整个序列中有65 个强酸性氨基酸、93 个强碱性氨基酸；氨基酸分子式为C2917H4659N841O847S32，原子总数为9296 个，预测其在280 nm 水溶液中的消光系数为67 030；预估半衰期＞20 h；预测其脂肪族氨基酸指数为78.0；亲水性分析表明HO蛋白的亲水性平均值为-0.471；蛋白质稳定性分析表明HO 蛋白不稳定指数为42.28，是一种不稳定蛋白质；在PROSITE 数据库中检索到HO基因编码的蛋白质的功能性基序和位点在215～370 之间，为内含肽DOD 归巢内切核酸酶，归巢核酸内切酶由内含肽和内含子编码的稀有切割酶组成，它们可以识别的DNA 序列比经典限制酶大得多。

如图2A 所示，HO基因编码的蛋白质的疏水性最大值为1.722。磷酸化位点分析预测可知（图2B），该基因编码的蛋白质序列中有21 个Ser、18个Thr、12 个Tyr。亚细胞定位预测分析发现，HO蛋白有7.50%的可能存在于细胞质中，有1.15%的可能存在于细胞质膜，有0.73%的可能存在于周质空间，因此将HO 蛋白定位于细胞核内。将该蛋白进行跨膜区分析（图2C），结果显示HO 蛋白不含跨膜区，该结论也支持了亚细胞定位分析的结果。

将本试验获得的HO基因片段进行RPS-Blast分析（图2D），结果显示该片段有4 个保守区域。其中，PRK14898 区域是一个信号接收区，具有DNA 指导的RNA 聚合酶亚基调节系统中激酶保守区域的功能；HintN 区域是分割结构域，以适应大量内切核酸酶的插入。

将HO 蛋白进行重复序列分析（图2E），结果表明在该蛋白质中可能存在19 个重复序列，但这些氨基酸序列并非完全相同。

利用Hopfield 神经网络（HNN）预测酿酒酵母W5 的HO 蛋白结构，发现其二级结构主要由不规则卷曲、α螺旋及延伸链构成（图2F）。其中，不规则卷曲占51.71%，α螺旋占27.82%，延伸链占20.48%（蓝色示α螺旋、红色示延伸链、紫色示不规则卷曲）。在得到该蛋白质二级结构基础信息的基础上，构建了其三级结构（图2G）。

3 讨论

近几年来，酿酒酵母配型研究已经从单纯的表观遗传控制方面[23-24]上升到对其机理及相关调控网络更加复杂的探究水平，人类探索未知的渴望和对科学严谨的追求态度，也使得酿酒酵母配型的研究更加完善和系统化。但目前对于酿酒酵母核酸内切酶HO基因的研究，主要还是围绕着人们所关心的代谢路径等方面的改造上。因此，我们对HO这一关键基因的生物信息学分析，可以在某些方面填补该基因在酿酒酵母研究领域的空白，为更好地利用这一基因，对目的菌株进行改造和重组打下坚实的基础。正如本文开头所提及的，随着科技的进步，人们在穷尽各种方法，利用现存科技手段，对酿酒酵母进行更加深入的功能发掘，这也在很大程度上导致了对于酿酒酵母的遗传稳定性[25]、代谢可控性及菌株的运行成本等的更高要求。

酿酒酵母作为研究真核细胞的“模式生物”，其某些研究成果可以转移到高等真核生物体内进行[7]，因此对酿酒酵母的研究一直较为活跃，而且在大量研究过程中，人们都直接或间接地对酿酒酵母的HO基因进行了修饰，用以获得其预期研究结果[14-30]。本研究对HO基因的生物信息学分析，不仅仅局限于对基因信息的简单陈述，而且还对该基因的转录水平、空间位置及酶学信息等进行了科学的计算机模拟，得到的数据与科学实践所得到的信息高度一致，这对于该基因的生物学信息汇总及完善有重要意义，可为今后在该领域的相关研究提供更加准确、便捷的HO基因信息，也可为研究路线的进一步优化提供一定的理论参考。

综上，本研究以实验室前期筛选得到的一株二倍体酿酒酵母W5（MATa/α）为出发菌株，利用PCR 技术从其全基因组中克隆得到该菌株的核酸内切酶基因HO片段，经测序后发现该序列无碱基缺失，且通过NCBI 的ORF Finder 程序分析发现该基因序列具有完整的开放读框，与NCBI中酿酒酵母Y169 的HO基因序列100%一致，与酿酒酵母YJM1326 的HO基因序列有99.94%的一致性。同时，我们利用生物信息学技术分析得到其

编码的HO 蛋白的强酸强碱性氨基酸所占比例有明显差异，与预测等电点相符，存在蛋白激酶位点，亚细胞定位分析HO 蛋白存在于细胞核内，属于碱性胞内蛋白。

图2 HO 蛋白生物信息学分析结果