miR-5688在三阴性乳腺癌细胞中下调固醇调节元件结合蛋白1的表达而抑制三阴性乳腺癌细胞增殖

张磊，姜棋予，曹哲丽，李静，杨晓妹，林晓萌

1. 河北大学附属医院 肿瘤内科，河北 保定 071000；2. 解放军总医院 第五医学中心，北京100039；3. 保定市第一中心医院 消化内科，河北 保定071000；4. 保定市第一中心医院 超声科，河北 保定071000；5. 河北大学附属医院 乳腺外科，河北 保定071000

随着临床诊疗技术和抗肿瘤药物的发展，内分泌依赖的乳腺癌（雌激素受体阳性）及人表皮生长因子受体2（HER2）表达阳性的乳腺癌相继出现了对症治疗药物，患者预后也有好转[1]。但是在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中，相关治疗策略的临床疗效有限，目前仍以化疗为主，对TNBC 发生与进展的分子机制尚不清楚，患者预后较差[2]。阐明TNBC 发生与进展的相关分子机制，对于研究和开发更为安全和有效的治疗策略具有重要意义。

与正常乳腺细胞相比，TNBC 细胞具有更为旺盛的物质摄取与能量代谢，其中脂肪酸代谢异常在其生长和转移中发挥重要作用。已证实，肿瘤细胞摄取的葡萄糖中约60%的碳原子用于脂质合成、能量储存及促肿瘤信号分子生成等[3]。固醇调节元件结合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP-1）是脂代谢的关键转录因子，能够直接激活多种基因的表达，这些基因参与脂肪酸、甘油三酯及胆固醇合成与摄取[4]。SREBP-1 不仅与糖尿病等多种代谢性疾病密切相关，也能在多种肿瘤的发生与进展中发挥作用[5]。现已证实，SREBP-1 在乳腺癌中表达阳性，但是对SREBP-1 的研究报道较少，在TNBC 中发挥的功能和调控机制尚不完全清楚。在本研究中，我们通过数据库预测发现miR-5688 可能作用于SREBP-1 mRNA 的3'非翻译区（UTR），进一步在患者来源TNBC（patients-derived TNBC，PDTNBC）细胞中验证了miR-5688 可抑制SREBP-1的表达；通过过表达miR-5688，可抑制PD-TNBC细胞的增殖、转移、侵袭与裸鼠皮下成瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

裸鼠为北京斯贝福公司产品；TNBC 细胞系MDA-MB-231 购自中国医学科学院基础医学研究所；5 例PD-TNBC 细胞系由本实验室保存，该细胞系为PD-TNBC 组织经细胞分离后培养得到的传代细胞；PD-TNBC 组织标本由本实验室收集保存，该组织标本为TNBC 患者手术切除得到的成对标本，共30 对，包含肿瘤组织以及癌旁组织，保存于RNAlater 溶液中。

miR-5688 检测试剂盒和抑制剂购自Thermo公司；细胞培养实验使用的各类常规试剂购自Hyclone 公司；细胞培养板等购自Corning 公司；含miR-5688 全序列（pre-miR-5688）的慢病毒载体购自Vigene 公司（山东济南）；转染试剂及含非特异性序列的空白对照miRNA 慢病毒载体购自Thermo 公司；嘌呤霉素、MTT 实验试剂盒为Amerresco公司产品；RNA 提 取、反转录及 定 量PCR 实验（qPCR）试剂盒购自ABI 公司；蛋白免疫印迹实验使用的抗体购自Santa Cruz 公司。

1.2 定量PCR检测

对本实验室收集的成对TNBC 组织标本，用RNA 提取试剂盒提取细胞中的总RNA 样品，按Ji等[6]及Liang 等[7]的方法，利用qPCR 检测SREBP-1与miR-5688 的表达。SREBP-1 正向引物为5'-A CTTCTGGAGGCATCGCAAGCA-3'，反向引物为5'-AGGTTCCAGAGGAGGCTACAAG-3'；miR-5688 正向引物为5'-CGCAGTAACAAACACCTGT-3'，反向引物为5'-GGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTGCT-3'；β-actin 正向引物为5'-CACCATTGGCAATGAGCG GTTC-3'，反向引物为5'-AGGTCTTTGCGGATGT CCACGT-3'。

1.3 细胞培养和转染

MDA-MB-231 与PD-TNBC 细 胞系在37℃、5% CO2培养箱中，用添加10%胎牛血清的DMEM培养液培养。依据试剂说明书进行病毒感染实验，设置过表达miR-5688 组（细胞转染包含miR-5688 全序列的慢病毒载体）、过表达miR-5688 并转染抑制剂组（稳定过表达miR-5688 后在细胞中转染miRNA-5688 的抑制剂）。待用慢病毒感染细胞后，再以嘌呤霉素进行筛选，获得稳定转染的细胞株，实现在MDA-MB-231 细胞系与PD-TNBC 细胞中对miR-5688 的过表达。对照组设置为转染含有非特异性序列的miRNA 的慢病毒载体。

1.4 细胞增殖实验

培养稳定过表达miR-5688、过表达miR-5688并转染抑制剂的MDA-MB-231 细胞与PD-TNBC细胞，用胰蛋白酶消化细胞后离心，用注射用生理盐水重悬细胞，再将细胞悬液接种在96 孔细胞培养板中，每孔接种细胞约2000 个，在起始时间点（0 h）和培养48 h 后分别进行MTT 实验，测定细胞样品的D490nm值。细胞增殖抑制率（%）=［（48h对照组D490nm-0 h 对照 组D490nm）-（48 h 实验 组D490nm-0h实验组D490nm）］/（48h对照组D490nm-0 h 对照组D490nm）×100%。

1.5 Western印迹

培养稳定过表达miR-5688、过表达miR-5688并转染抑制剂、对照组的MDA-MB-231 细胞与PD-TNBC 细胞，提取细胞蛋白样品，按照文献[8]描述的方法进行Western 印迹实验。研究使用的兔抗人SREBP-1 抗体为1∶500 稀释，兔抗人β-actin单克隆抗体为1∶5000 稀释，HRP-羊抗兔抗体为1∶5000 稀释。印迹条带照片用Image J 软件进行灰度扫描后计算抑制率。抑制率（%）=［（对照组指定条带图像密度/对照组内参的图像密度）-（实验组指定条带图像密度/实验组内参的图像密度）］/（对照组指定条带图像密度/对照组内参的图像密度）×100%。

1.6 Transwell实验

培养稳定过表达miR-5688、过表达miR-5688并转染抑制剂的MDA-MB-231 细胞与PD-TNBC细胞，接种于Transwell 板的小室中，按照文献[9]描述的方法进行Transwell 实验。在进行细胞侵袭实验（In vitroinvasion）前，小室中预铺细胞外基质胶（ECM 胶）；进行细胞转移实验（In vitromigration）时，则直接将细胞接种在小室中。细胞在小室中培养24 h 后会由于自身的侵袭作用或转移作用透过小室中的微孔而进入下层，用结晶紫染料标记、拍照，再用无水乙醇或冰醋酸萃取细胞中的染料，读取D547nm值。抑制率（%）=（对照组D546nm-实验组D546nm）/（对照组D546nm）×100%。

1.7 裸鼠皮下成瘤实验

培养稳定过表达miR-5688、对照组的MDAMB-231 细胞与PD-TNBC 细胞，制备细胞悬液并接种裸鼠皮下，待生长3～4 周形成裸鼠皮下肿瘤组织。用游标卡尺测量肿瘤组织的长度（长轴）与宽度（短轴），计算肿瘤体积。肿瘤体积=肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2。剥离肿瘤组织，称重，计算抑制率。抑制率（%）=（对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积）/（对照组肿瘤体积）×100% ，或（对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量）/（对照组肿瘤重量）×100%。

1.8 统计分析

用SPSS24.0 软件进行统计分析，2 组数据间比较采用t检验，P＜0.05 视为2 组间有统计学显著差异；用Graphpad 6.0 软件进行相关性分析。

2 结果

2.1 过表达miR-5688能够下调SREBP-1的表达

SREBP-1 的Gene Symbol 为SREBF1，在miRDB数据库中检索SREBF1，我们发现hsa-miR-5688 是最有可能作用于靶基因SREBP-1 的miRNA，其Target Score 为88 分。根据miRDB 数据库分析，如图1A 所 示，miR-5688 存在 于SREBP-1 mRNA 的3'UTR 的识别序列。通过数据库检索，miR-5688 与SREBP-1 可能存在抑制作用关系。

我们对30 对TNBC 组织样本的SREBP-1 和miR-5688 的表达进行检测，发现SREBP-1 在肿瘤组织中的表达显著高于癌旁组织（图1B），而miR-5688 在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织（图1C），二者的表达在TNBC 组织中呈负相关趋势（y=-0.6607x+0.06929；P＜0.0001）。

进一步探讨miR-5688 与SREBP-1 的作用关系，我们在MDA-MB-231 细胞中设置过表达miR-5688 组、过表达miR-5688 并转染抑制剂组，结果如图2 所示，过表达miR-5688 组能够显著降低SREBP-1 的表达，抑制率约为60%；同时转染miR-5688 抑制剂组基本无抑制作用。上述结果表明，SREBP-1 在PD-TNBC 癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且该成对组织样本中miR-5688 与SREBP-1 的表达负相关；过表达miR-5688 能够下调SREBP-1 的表达。

2.2 miR-5688能够抑制PD-TNBC细胞的增殖、转移与侵袭作用

对MDA-MB-231 细 胞和5 例PD-TNBC 细胞进行MTT 实验，检测过表达miR-5688 组和过表达miR-5688 并转染抑制剂组对细胞增殖的影响。结果见表1，过表达miR-5688 组能够显著抑制MDA-MB-231 细胞和PD-TNBC 细胞的增殖作用，转染抑制剂组则抑制作用不明显。

表1 miR-5688 对MDA-MB-231 细 胞和PD-TNBC 细胞增殖的抑制率

图1 miR-5688 与SREBP-1 mRNA 在TNBC 组织样本中表达呈负相关趋势

图2 过表达miR-5688 能够抑制MDA-MB-231 细胞中SREBP-1 的表达

Transwell 实验结果显示（图3、4），miR-5688能够抑制MDA-MB-231 细胞的转移与侵袭作用；进一步对5 例PD-TNBC 细胞的细胞转移与侵袭作用进行检测，结果见表2，发现miR-5688 对这5例PD-TNBC 细胞也有类似的抑制作用。

图3 miR-5688 能够抑制MDA-MB-231 细胞的侵袭作用

图4 miR-5688 能够抑制MDA-MB-231 细胞的转移作用

表2 miR-5688 对MDA-MB-231 细胞和PD-TNBC 细胞转移与侵袭的抑制率

2.3 miR-5688能够抑制PD-TNBC细胞在裸鼠体内的成瘤作用

设置过表达miR-5688 组为MDA-MB-231 细胞和PD-TNBC 细胞转染含miR-5688 全序列慢病毒载体，对照组为转染含非特异序列miRNA 的慢病毒载体。将2 组细胞制成细胞悬液后经皮下注射裸鼠皮下，经过4 周生长后收集皮下肿瘤，结果如图5 显示，在MDA-MB-231 细胞中过表达miR-5688 能够显著抑制皮下肿瘤的生长，其体积和质量的抑制率约为60%。

图5 miR-5688 抑制MDA-MB-231 细胞在裸鼠皮下的成瘤作用

进一步将5 例PD-TNBC 细胞种植于小鼠皮下，收集皮下肿瘤并计算质量抑制率，结果如表3，miR-5688 在5 例PD-TNBC 细胞 中同 样 具有 在裸鼠体内的成瘤作用。

3 讨论

SREBP-1 是恶性肿瘤细胞脂类合成代谢的主要调控枢纽，一方面介导脂肪酸合成相关基因的转录以促进细胞中的脂类积累[3-5]，另一方面能够促进肿瘤细胞对葡萄糖的摄取作用（葡萄糖作为脂肪酸合成的原料），最终影响肿瘤组织局部的微环境。SREBP-1 在肝脏肿瘤中的报道较多，在乳腺癌中的报道较少。本研究表明，SREBP-1 在TNBC 组织中的表达高于癌旁组织中，利用miR-5688 下调SREBP-1 的表达能够抑制PD-TNBC 细胞增殖、转移与侵袭作用。除SREBP-1 外，SREBP 蛋白家族还有另一成员，即类固醇、类固醇类激素代谢的调控枢纽SREBP-2[10]。乳腺癌的发生进展与内分泌系统、类固醇类激素密切相关，因此今后进行SREBP-2 的研究亦具有重要意义。miRNA 是一类RNA 聚合酶Ⅱ转录的非编码RNA，能够通过序列特异性识别目标基因mRNA的3'UTR，最终造成目标基因的表达沉默[12]。在肿瘤中miRNA 的表达会出现变化，发现和鉴别癌基因、原癌基因的miRNA，利用miRNA 的病毒载体转染细胞能够发挥抗肿瘤的作用。本研究不仅使用了MDA-MB-231 这一TNBC 的常用肿瘤模型，也使用了患者来源的肿瘤细胞系，这不仅有助于TNBC 相关研究，也能够为今后实现更为有效的TNBC 治疗策略提供参考。

表3 miR-5688 对MDA-MB-231 细胞和PD-TNBC 细胞在裸鼠皮下成瘤的质量抑制率