流式细胞术在血小板功能检测诊断中的应用

黄 恺

解放军第425医院检验科，海南省三亚市 572000

血小板是应对血管损伤和防止过度失血的主要因素。这些小的血液成分能够迅速附着在损伤部位，形成止血塞，以限制异常的失血。血小板在止血中的功能大致分为四个不同的过程，即血小板黏附、活化、分泌和聚集。血小板功能障碍(Platelet function disorder，PFD)的特征是容易或自发性瘀伤、黏膜出血或出血时间延长，并且具有异质性表型[1]。它们可以是遗传的，也可以是后天的，并且可能与低血小板数量(如血小板减少症)有关[2]。PFD按照性质的不同可以分为：血小板无力症(GT)、储贮池疾病(SPD)和巨大血小板综合征(BSS)[3]。

准确的诊断对于生命质量的提高和预防性治疗危及生命的出血发生是至关重要的。PFD的实验室诊断包含许多不同的技术。目前的诊断工具可以鉴定严重的PFD，尤其是GT；然而，对SPD和BSS等在内的轻度PFD的鉴定能力相对较弱。而流式细胞术可以评估血小板计数低的样本中血小板功能，因此已被建议作为目前诊断工具的可行替代方案。但是，流式细胞术需要对轻度PFD进行验证并进行标准化，才能作为常规诊断手段。在本综述中，我们将讨论PFD的当前诊断策略、流式细胞术在血小板诊断中的潜在作用以及引入PFD新诊断检测面临的挑战。

1 疑似血小板功能障碍的诊断检查

在血小板功能检测中，诊断PFD最常用的方法是光传输聚合测定法(Light transmission Aggreg-ometry，LTA)[4]。LTA可以测量不同浓度的激动剂刺激后，通过富含血小板的血浆(PRP)中传输的光。当血小板受到刺激时，由于血小板聚集，通过样品的光传播随时间增加，因此可以被认为是血小板功能的可靠测量。但是，并非所有SPD患者均显示LTA血小板聚集减少，这也很好地解释了有些患者的LTA正常时仍然不能排除SPD。因此，在诊断时需结合别的检测结果共同分析。虽然LTA是诊断不同严重PFD的重要检测方法，但该检测方法对诊断轻度PFD缺乏敏感性，总体敏感性估计在34%～60%之间。此外，LTA的主要缺点是研究血小板减少样品中的血小板功能结果不可靠。其次是标准化较差，尤其是对于激动剂的浓度和数量的标准不统一，因此不同实验室的检测结果的一致性较差。不仅如此，LTA还需要较高的人力成本以及较多的全血量，因此不适用于新生儿和幼儿的PFD诊断[5]。

鉴于目前可用的检测方法存在较大的缺陷，因此我们急需新的诊断PFD的方法，最好包括收集少量的血液。目前，流式细胞仪已被ISTH科学与标准化委员会推荐为诊断PFD的可靠诊断工具[3]。流式细胞术是一种应用广泛、用途广泛的技术，能够用于研究血小板生物学功能等的许多方面。流式细胞术能够检测悬浮细胞中单个细胞的生物学特性，因此有助于快速分析大量血小板的功能和表型。流式细胞术相对于常规血小板功能测试的主要优点是所需的全血量最少，并适用于血小板减少症患者[6]。它利用荧光抗体快速分析单细胞上的多种细胞标记物，并且与LTA相比具有几个优点(表1)。当然，鉴于流式细胞仪存在一定的缺陷，目前只能在少数诊断实验室作为一线实验检测手段。

表1 流式细胞术和LTA的优点和缺点

2 血小板功能的流式细胞术检测

2.1 实际问题 流式细胞术可以检测一个样品内的不同血小板标记物，并且通过荧光染料或抗体分析特异性受体标记，可以很容易地将正常大小的血小板与其他血液成分(红细胞和白细胞)分离开来。但是，当血小板识别仅基于前向散射和侧向散射时，应注意避免溶血样本，因为在含有大量细胞碎片或带有气泡的样本中，检测的结果会与血小板部分重叠，从而妨碍了准确的血小板识别。为了防止这些问题，应加入针对血小板特异性标记物(如GP1bα或CD41)的抗体，以帮助区分血小板与红细胞或细胞碎片[7]。

2.2 血小板反应性测试 血小板功能测试应包括对导致血小板活化的信号传导途径的评估。最常见的相关途径主要有通过GPVI刺激的胶原途径、凝血酶途径[蛋白酶激活受体1(PAR-1)和PAR-4起作用]、ADP途径(嘌呤能受体P2Y12的作用)和血栓素A2途径。这些途径均可以用标准化的激动剂组来完成评估。比如，在流式细胞术中，测试胶原途径的优选激动剂是交联的胶原相关肽。需要注意的是，用于评估血小板反应性的最佳激动剂浓度，在不同实验室或不同测定目的中是不一样的。例如，在出血性疾病的血小板功能测试时，需要高激动剂浓度来检测血小板的反应性[8]。与LTA相比，一方面，由于流式细胞术允许基于中值荧光活性的完全定量分析，可以确定血小板的真正活化电位；另一方面，流式细胞术中较低的激动剂浓度或浓度梯度在血小板反应性增加的情况下更合适。

2.3 血小板分泌测试 使用整体电子显微镜对每个血小板的致密颗粒进行计数是诊断SPD的金标准[9]。但是，这种技术仅能在少数实验室中使用，并且非常耗时。在血小板活化时，血小板表面能够表达P-选择素，CD63表达和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)等细胞标志物，而使用流式细胞术，可以相对容易地测量血小板的这些标记物的改变情况。因此，它们可以用作血小板活化的标志物。但是低CD63的表达不仅可由血小板活化、分泌引起，也可因为血小板致密颗粒的缺失引起，因此不足以诊断SPD。

静息血小板中对麦帕克林(mepacrine)摄取的评估是流式细胞定量密集颗粒含量的另一种方法。mepacrine是一种荧光吖啶衍生物，对腺嘌呤核苷酸有很高的亲和力，主要存在于血小板密集颗粒中。因此，mepacrine标记的致密颗粒可用流式细胞术进行定量。尽管SPD对mepacrine的吸收量较低，但该技术还没有得到验证，其诊断性能也没有与其他SPD特异性诊断测试进行比较[10]。

3 当前流式细胞术在临床环境中血小板功能测试的应用

3.1 轻微出血疾病的诊断 国际血栓和血液病学会最近公布了一项关于轻度出血障碍患者的诊断调查，共包括了37个国家的202个实验室，发现有57%的实验室使用流式细胞仪[11]，其中有23%实验室用流式细胞仪作第一步测试，约有2/3的实验室中用作第二步测试。其主要用途是研究罕见遗传性血小板疾病如Glanzmann血小板无力和Bernard-Soulier综合征中已知的受体表达水平。 在78个实验室中，使用流式细胞仪研究α颗粒释放、测量激活后P-选择素的程度以及纤维蛋白原受体GPⅡb/Ⅲa的激活[但仅使用少量激动剂，通常是ADP和PAR1-AP(TRAP-6)]；另外还有不到30个实验室进行了其他测试，比如致密颗粒释放，促凝血活性或溶酶体释放。值得注意的是，在每年调查的近14 000名患者中，60%的患者没有发现异常，只有9%的患者接受了明确的分子诊断。这表明当前的检查方法可能不足以指示疾病发生的潜在原因。

3.2 输血医学 流式细胞术通常用于输血医学，以研究血小板浓缩物在储存期间的体外质量，并评估不同的制备和储存条件对血小板性质的影响[12-13]。然而，大多数研究没有涉及任何血小板激动剂的添加情况，而是研究了受体自发表达(gpib152155和GPⅡb/Ⅲa)、激活标记(p-selectin或CD63)和凋亡标记(annexin V)的变化[12，14]。目前，人们对激动剂诱导的表达以及它如何受储存影响的知识相对较少。最近，研究人员提出激动剂诱导的微粒形成和LAMP-1暴露可以作为检测储存期间血小板功能恶化的潜在新标记物[15]。然而，这些发现如何与输注血小板的体内表现相关仍然是未知的。只有少数研究调查了血小板活化标志物的表达与体内活力之间的相关性，但是迄今为止报道的相关性较低且研究之间存在差异。因此，使用流式细胞术研究血小板活化潜力可能有助于在这方面获得更好的结果。

3.3 抗血小板药物测试 目前，为了检测血小板P2Y12受体的功能，研究者开发了一种商业的细胞流式检测技术，目的是研究针对该受体的抗血小板药物(如氯吡格雷、普拉格雷、替格列罗)的作用。在血管扩张剂刺激的磷蛋白(VASP)测定中，将血小板与前列腺素E1(PGE1)或ADP+PGE1一起温育，并测量VASP的磷酸化状态以确定活化P2Y12受体的程度。将该试验与其他在临床环境下测量P2Y12抑制的方法进行了比较，发现“无应答者”的频率与所进行的试验有很大的不同[16]。另外，在一些研究中，这些分析之间的相关性很低[17]。有很多研究描述了检测血小板GPⅡb/Ⅲa拮抗剂的直接或间接方法以及基于花生四烯酸检测阿司匹林的方法，但没有一种方法获得广泛关注或商业用途。最近的一项研究比较了流式细胞术和其他方法来确定双抗血小板治疗患者的血小板功能，发现各种不同的基于花生四烯酸的方法之间的相关性很低[18]，可能是花生四烯酸能够裂解细胞，但这需要进一步研究证实。

4 小结

流式细胞术可以同时检测血小板的性质和功能，是为数不多的几个血小板功能测试的方法之一。由于流式细胞术的许多实际优点、在不同学科中的可能应用以及评估不同血小板功能的能力，PFD的诊断可能受益于流式细胞术。这种方法非常适用于血小板减少患者，因为仅仅只需要少量的血液。此外，还需要将流式细胞仪检测结果与临床结果结合起来进行研究，并与其他检测进行比较研究。总之，流式细胞术可以增强疾病的诊断率，改善生活质量和为治疗策略的制定提高参考，并可能最终提高解析复杂基因型—表现型之间相关性的能力。