肾上腺素能α受体在丙泊酚麻醉觉醒中的作用

刘君逍，刘程曦，吕 萍，付 豹

0 引 言

丙泊酚因其起效迅速，患者麻醉苏醒时间短，不良反应小，已经成为临床上不可或缺的麻醉药物，但是其具体的神经作用机制现在仍是未解之谜。脑电图研究提示：全身麻醉药物导致意识消失和恢复与大脑自然睡眠和觉醒的脑电变化有类似之处，而全身麻醉时意识改变的过程可能是大脑在睡眠与清醒之间的迅速转换［1］。功能核磁共振研究也发现，在丙泊酚麻醉和睡眠状态下，下丘脑和丘脑区均抑制输出增强，且脑电图也都以慢波节律为主，这些类似的变化说明全身麻醉和睡眠可能通过共同的神经环路发挥作用［1-5］。因此现代全身麻醉研究认为睡眠-觉醒相关通路可能是研究全身麻醉药物作用机制的一个重要方向［6］。

室旁核位于背侧中线丘脑，接受来自于基地前脑、中脑和间脑的广泛投射［7］。室旁核参与调控多种生理功能如：睡眠-觉醒调控、奖赏行为、觅食行为、能量平衡以及情绪相关行为等［8-10］。近年来大量的研究均提示室旁核与调控麻醉觉醒的核团有密切的解剖和功能联系，如接收来自蓝斑的去甲肾上腺素能，中脑导水管灰质的多巴胺能，中缝背核的五羟色胺能，臂旁核的谷氨酸能投射，外侧下丘脑的Orexin投射［11-13］。本实验室前期研究发现中央内侧丘脑的肾上腺素能传输系统参与调解丙泊酚麻醉苏醒同时引起皮层脑电图觉醒，而不引起麻醉诱导过程改变［14］，提示室旁核参与睡眠-觉醒过程，那么在丙泊酚麻醉-觉醒过程中室旁核的肾上腺素能受体起着怎么作用呢？故本实验拟激动/抑制室旁核的肾上腺素α受体观察其对丙泊酚麻醉苏醒过程的影响，探索室旁核在全身麻醉中发挥的作用，以期为全身麻醉作用机制的研究提供一点理论依据，从而最大化的降低麻醉对患者的不良影响，如苏醒延迟、术后认知功能障碍等［15］。

1 材料与方法

1.1 实验动物70只健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2014-0011。饲养于贵州省麻醉与器官保护基础研究重点实验室SPF级动物房。饲养环境：不限制大鼠活动、饮水、饮食，动物房采用自动控制的12 h光/12 h暗周期，室内温度23～26℃，相对湿度为60%左右。

1.2 实验药物1%丙泊酚（Fresenius Kabi，国药准字 J20160089）、去 甲 肾 上 腺 素（Alfa Aesar，LO8O87）、酚妥拉明（Sigma，P7547-100MG）、普萘洛尔（Sigma，P0884-1G）、戊巴比妥（Merck，P11011）、水合氯醛（Aladdin，C104202）、一抗：Anti-c-fos亲和纯化兔抗体（synaptic system ，226003）、二抗：羊抗兔IgG（Life Technologies，A11008）。

1.3 微注射模型10%戊巴比妥麻醉后（45 mg/kg，腹腔注射），固定于脑立体定位仪，切开头皮充分暴露颅骨，调节Bregma点和Lambda点，使其在同一水平位置。根据大鼠脑立体定位图谱（Watson and Paxinos）定位室旁核坐标（前后：-2.7 mm，左右：0 mm，深度：5.4 mm）和右侧前额叶mPFC坐标（前后+3.7 mm，右2 mm，深度1.5 mm），行颅骨钻孔术暴露硬脑膜并轻轻拨开，置入微注射套管针、脑电记录电极和参比电极。采用牙科水泥将套管针和电极固定在颅骨表面。术后3 d腹腔注射青霉素20 U降低感染率，独笼饲养于本实验室SPF级动物房。待术后恢复7 d，观察无行为学异常后进行下一步实验。

1.4 光纤钙信号记录模型随机数字表法选取12只大鼠，按上述的方法麻醉固定老鼠，暴露颅骨并调平。在室旁核处注射病毒。以0.15µL/min的速度吸取病毒（rAAV-hSyn-Gcamp6s-WPRE-pA），以0.05µL/min的速度注射0.35µL病毒到目的位点，注射针原位停留10 min。完成注射后将光纤陶瓷插芯放置在注射位点上方200µm处并固定。完成后单笼饲养4周，待病毒转染。

1.5 免疫荧光实验8只雄性SD大鼠随机数字表法分为两组：丙泊酚组和对照组（n=4）。丙泊酚组与对照组均在1.5%异氟醚吸入麻醉下行大鼠尾静脉穿刺置管，置管成功后置于诱导箱内，待大鼠苏醒并自由活动0.5 h。丙泊酚组推注丙泊酚快速诱导使大鼠的意识消失（11 mg/kg，静脉注射），连接微注射泵连续泵注丙泊酚［48 mg/（kg·h）］，麻醉维持2 h后灌注取脑。2 h后对照组10%水合氯醛麻醉后（4 mg/kg，腹腔注射），立刻在剑突下取适当的切口，充分暴露大鼠心脏，4%的多聚甲醛灌流固定脑组织，灌流结束后断头咬除颅骨，取出脑组织浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，再将其浸泡在30%葡萄糖溶液中。脑组织沉底后，根据解剖标志确定室旁核的位置，利用振荡切片机进行冠状位组织切片，厚度为30µm。封闭液封闭2 h-一抗孵育48 h-摇床脱色洗片-荧光二抗孵育2 h-摇床脱色洗片-荧光显微镜观察，比较在室旁核区丙泊酚组和对照组的cfos阳性表达量的强度。

1.6 光纤钙信号记录实验在避光条件下，测量原始的光强待基线稳定。大鼠在透明诱导箱内适应10 min后，连接跳线与大鼠头部的陶瓷插芯，记录大鼠的光纤信号。清醒状态下记录10 min，然后以11 mg/kg的剂量尾静脉单次注射丙泊酚，标记大鼠翻正反射消失（loss of right reflex，LORR）和翻正反射恢复（recovery of right reflex，RORR），待大鼠翻正反射恢复后继续记录10 min。LORR定义为将大鼠置于仰卧位，30 s内不能从仰卧位变为俯卧位。RORR定义为大鼠在仰卧位时，5 s内能够恢复正常体位，即四脚同时着地。

1.7 室旁核微注射实验将室旁核脑区微注射模型大鼠随机数字表法分为4组：去甲肾上腺素组、酚妥拉明组、普萘洛尔组和等渗盐水组（n=10）。

1.7.1 行为学记录尾静脉置管后将大鼠放入诱导箱内适应30 min，然后取下微注射导管帽，拔出导管芯并连接好微注射内管。4组大鼠分别给予1µL去甲肾上腺素、酚妥拉明、普萘洛尔和等渗盐水后，取出微注射管芯。尾静脉连接延长管连续泵注丙泊酚［48 mg/（kg·h）］，翻正反射消失后继续维持麻醉20 min，然后停止泵注丙泊酚，观察并记录大鼠翻正反射恢复时间RORR时间。RORR时间以停止麻醉维持时间为起点，大鼠翻正反射恢复的时间为终点计算而得。

1.7.2 脑电记录尾静脉置管后将大鼠放入诱导箱内适应30 min，然后经尾静脉推注丙泊酚快速诱导（11 mg/kg），使大鼠意识消失，连接好微注射内管。尾静脉连接延长管连续泵注丙泊酚麻醉维持30 min［48 mg/（kg·h）］，并且连续记录mPFC脑电活动，观察室旁核微注射对大鼠mPFC脑电活动［δ波（1～4 Hz）、θ波（4～8 Hz）、α波（8～12 Hz）、β波（12～25 Hz）、γ波（25～60 Hz）］的影响。在麻醉维持的第20 min开始室旁核脑区微注射，4组大鼠分别给予1µL去甲肾上腺素、酚妥拉明、普萘洛尔和等渗盐水。麻醉维持30 min停止泵注丙泊酚和脑电记录，取出微注射管芯和延长管。

1.8 免疫荧光及免疫组化验证脑区微注射实验结束后均要进行组织学验证，确定导管插入位置。10%戊巴比妥钠麻醉后（45 mg/kg，腹腔注射），灌注固定脑组织并脱水切片，行HE染色后，将切片置于显微镜下观察。对照大鼠脑立体定位图谱，将微注射导管植入位置准确的数据进行统计学分析，位置不正确的数据舍弃。

1.9 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（±s）表示，否则以中位数（上四分位数～下四分位数）［M（P25～P75）］表示。在符合正态分布和方差齐的条件下，比较行为学实验结果RORR时间采用独立样本t检验进行分析，微注射前后脑电功率谱中的脑电图变化以及LORR和RORR事件前后钙信号的差异通过配对t检验分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫荧光与对照组相比，丙泊酚组的c-fos表达量明显下降，这一结果表明大鼠室旁核神经元的活性在丙泊酚麻醉时降低。见图1。

图1 镜下观察c-fos形态（免疫荧光染色×100）Figure 1 Expression of c-fos in the PVT neurons of the rats in the control and propofol anesthesia groups（IHS ×100）

2.2 光纤钙信号记录在丙泊酚诱导LORR时，相比于清醒基线，诱导期Ca2+信号增加；但麻醉早期和麻醉期Ca2+信号均显著减少（P＜0.05）。在出现RORR期间，观察到室旁核Ca2+信号的骤然增加；与麻醉基线相比，苏醒早期和苏醒期Ca2+信号显著增加（P＜0.05）。见图2。

图2 尾静脉单次注射丙泊酚发生LORR和RORR光线钙信号记录结果Figure 2 PVT neural dynamics in response to propofol anesthesia

2.3 室旁核微注射与等渗盐水组相比，去甲肾上腺素组的苏醒时间缩短（837.8 svs647.7s，P＜0.05），且微注射后脑电图的δ波频率降低（P＜0.05），β波频率增高（P＜0.05）；与等渗盐水组相比，酚妥拉明组丙泊酚麻醉的苏醒时间（1045.1 s）延长（P＜0.05），且微注射后脑电图的δ波频率增高（P＜0.05）；与等渗盐水组相比，普萘洛尔组苏醒时间（834.2 s）无变化，微注射后脑电图没有改变（P＞0.05）。见表1。

表1 丙泊酚麻醉下室旁核微注射前后的脑电结果（n=10）Table 1 EEG changes under PVT microinjecting in propofol anesthesia（n=10）

3 讨 论

室旁核是丘脑中线核团之一，位于丘脑背内侧前后轴，具有密集的谷氨酸能神经元，组成丘脑非特异投射系统。室旁核是觉醒中枢的关键丘脑节点，抑制室旁核神经元的活性可以导致清醒时间的减少，而室旁核神经元的激活加速睡眠到觉醒的转换和缩短异氟醚麻醉苏醒时间［16］。早期研究表明［8］，睡眠时期室旁核区域的c-fos表达量明显低于清醒时期。Ren等［16］研究也发现室旁核神经元的c-fos表达量呈现昼夜节律相关，而且相较于中线丘脑的其他核团，无论清醒或睡眠时，室旁核都有较高水平的c-fos表达；但是清醒状态下室旁核神经元细胞的Ca2+活性和c-fos表达量均明显高于睡眠状态。我们实验也发现丙泊酚麻醉期间室旁核区域cfos表达量明显低于苏醒后，而且丙泊酚麻醉翻正反射消失时室旁核神经元Ca2+活性下降，在丙泊酚麻醉期间神经元活动处于较为稳定的低水平状态；在翻正反射恢复时室旁核神经元Ca2+活性骤升。光纤钙信号的实时记录能较为客观的反应神经元的活性，同时c-fos也是反应神经元活性的经典指标。本实验通过记录室旁核麻醉和清醒状态下的c-fos和Ca2+活性提示：丙泊酚可能通过抑制室旁核神经元的活动诱导麻醉，故为了进一步研究室旁核在丙泊酚麻醉中作用，采用微注射和脑电结合的方式探讨其具体作用机制。

基于本实验前期研究发现特异性毁损斑马鱼蓝斑核（locus coeruleus，LC）的去甲肾上腺素能神经元或DBH基因敲除的斑马鱼（NE合成酶）均能加速丙泊酚麻醉诱导，延长苏醒，提示LC-NE系统是脑内重要的促觉醒通路，也是全身麻醉药物作用的重要靶点［17］。Hu等［18］也发现 DBH基因敲除的小鼠（NE合成酶）对吸入麻醉药敏感性增强，主要表现为小鼠的诱导时间变短，恢复时间变长。Vazey等［19］采用化学遗传学技术选择性地激活大鼠的LC-NE神经元，使异氟醚麻醉诱导时间显著延长，而异氟醚麻醉的苏醒时间明缩短。以上研究均表明LC-NE系统调控全身麻醉苏醒过程，但LC-NE上行作用靶点和具体机制至今仍不明确。另有研究发现在丙泊酚麻醉中以推挽灌流技术洗脱新西兰兔室旁核的NE发现室旁核的NE释放显著降低，但依托咪酯则不会影响室旁核的NE释放。基于大量研究证明LC有大量投射到室旁核［8，12-13］，故我们选取室旁核微注射去甲肾上腺素，及α受体拮抗剂酚妥拉明，β受体拮抗剂普萘洛尔，观察研究室旁核肾上腺素能神经元在丙泊酚麻醉苏醒过程中作用。

本实验发现：与对照组相比，室旁核微注射NE可以加速丙泊酚麻醉的苏醒，且伴随δ波减少，而β波增多；微注射酚妥拉明可以明显延长丙泊酚麻醉的苏醒时间和增加δ波、θ波比率，但普萘洛尔则不影响丙泊酚麻醉苏醒时间和脑电。脑电图能较为客观的反应皮层神经元的兴奋性，一般认为睡眠期间是以高幅低频＜8 Hz的（δ波、θ波）为主；在清醒期间则是以低幅高频的β波为主。最近有报道采用光遗传学技术，特异性激活室旁核神经元可以产生从快速动眼睡眠到清醒的转变，以及清醒状态下脑电图δ波的减少；而毁损室旁核神经元可以增加清醒状态时脑电图的δ波［16］。早有研究报道静脉注射α 2受体激动剂可乐定延长丙泊酚麻醉诱导时间伴随着皮层NE释放减少，而拮抗剂育亨宾则会产生相反的效果。而特异性激活LC-NE神经元不仅加速异氟醚麻醉大鼠的苏醒，且伴随皮层的δ波比率下降，θ波比率升高［20］。Pillay和其同事研究发现基底前脑Meynert基底核微注射NE促进地氟醚麻醉的觉醒，降低前额叶皮层δ波比率，表明基底核NE通路可能通过上行激活皮层调解麻醉深度［21］。近期研究发现CMT微注射NE加速丙泊酚麻醉苏醒并引起前额叶皮层δ波减少，并且采用膜片钳技术发现NE可以减弱丙泊酚引起的CMT内抑制性GABA的释放，削弱丙泊酚的对CMT抑制效应［14］。Du等［17］也发现丙泊酚可以引起斑马鱼LC神经元超极化。我们的研究也提示室旁核参与调控丙泊酚的苏醒过程，并且可能通过作用于室旁核的肾上腺素能α受体参与丙泊酚麻醉觉醒和引起皮层的觉醒。

基于我们的实验，我们推测室旁核是丙泊酚作用的靶点之一，而室旁核的肾上腺素能输入可能是通过激活α受体发挥其促觉醒效能。