HPLC同时测定咽炎片中4种指标性成分的含量

李怀伟,马昌豪,冯思腾,张 朋

(菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274000)

咽炎片由玄参、百部、款冬花(制)、木蝴蝶、板蓝根等12味药材组成，为《卫生部药品标准》第二册(中药成方制剂)收载品种，临床常用于慢性咽炎引起的咽干，咽痒，刺激性咳嗽等症[1]。咽炎片药材成分多，现有标准和文献多通过薄层色谱和单一成分含量测定进行质量控制[1-5]，难度较大。通过同时测定多种成分的含量能更全面的反映药品的内在质量；本实验建立了高效液相色谱法同时测定咽炎片中木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁的含量，能够为咽炎片质量控制提供方法，保障用药安全。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1260高效液相色谱仪(美国安捷伦)；XS105 DualRange型十万分之一天平(METTLER TOLEDO)；FRQ-1006HT型超声波清洗器(杭州法兰特)。

1.2 药品与试剂

甲醇、磷酸(色谱纯，科密欧公司)；木蝴蝶苷B(中国食品药品检定研究院，批号：111915-201603)；黄芩苷(中国食品药品检定研究院，批号：111715-201720)；肉桂酸(中国食品药品检定研究院，批号：110786-201604)；芦丁(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201409)；咽炎片(市售，批号20180104，20180207，20180106)。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁对照品各适量，分别加甲醇制成每1 mL含木蝴蝶苷B0.2388 mg、黄芩苷0.1917 mg、肉桂酸0.0522 mg、芦丁0.2078 mg的贮备液，再取贮备液适量，加甲醇制成每1 mL含木蝴蝶苷B23.88 μg、黄芩苷19.17 μg、肉桂酸5.22 μg、芦丁20.78 μg的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取本品20片，除去包衣，研细，取约3.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min(功率250 W，频率40 kHz)，冷却至室温，用甲醇补足失重，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性溶液制备

按工艺方法制备缺木蝴蝶、玄参和款冬花(制)的阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件和系统适用性实验[6-8]

色谱柱为Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，3 μm)；以甲醇为流动相A，0.35%磷酸为流动相B，梯度洗脱(0～25 min，30%A；25～30 min,30%→43%A；30～50 min，43%A；50～51 min，43%→45%A；51～65 min，45%A；65～70 min，30%A)；流速：0.6 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积10 μL，检测波长280 nm。理论板数以木蝴蝶苷B峰计应不低于3000，目标峰与相邻峰分离度均大于1.5。

林语堂的“视读者为知己”还体现在他译创作品的一些细节之处。例如，《吾国吾民》（束君君2018:72）的正文开头写道：...for behind the creation of literature and the events of history there is always the individual who is after all of prime interest to us.其翻译为“因为在文学创作和历史事件的背后，总是那些单个的人使我们产生最大的兴趣。”

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验

取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性溶液，依“2.2”项下色谱条件进样分析。木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁能较好的分离，峰形均良好，阴性对照无干扰。结果见图1。

图1 混合对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液的高效液相色谱图

2.3.2 线性关系考察

分别精密吸取“2.1.1”项下的对照品贮备液0.10、0.30、0.50、1.00、2.00、3.00 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。在“2.2”项色谱条件下进行测定，以峰面积值为纵坐标(y)，浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)进行线性回归，结果见表1。各成分在相应范围内均呈良好的线性关系。

表1 回归方程及线性范围

2.3.3 精密度试验

精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液10 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁的RSD分别为0.17 %、1.02 %、0.68 %、0.33 %(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

2.3.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下于0，4，8，16，24，48 h时进样，测定峰面积，结果木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁的RSD分别为0.69 %、1.25 %、0.86 %、1.05 %(n=6)，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验

取含有量已知(木蝴蝶苷B0.2753 mg·g-1、黄芩苷0.0850 mg·g-1、肉桂酸0.1002 mg·g-1、芦丁0.2132 mg·g-1)的同一样品适量，精密称取6份，每份1.5 g，精密加入等量的木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁对照品，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，结果木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁的平均回收率分别为99.39%、98.98%、98.99%、99.22%；RSD分别为0.49%、0.52%、1.17%、0.39%。

2.4 含量测定

取3批样品，按“2.1.2”项下方法制备，按“2.2”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积，计算各组分的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

分别考察了甲醇-冰乙酸、乙腈-冰乙酸、甲醇-磷酸和乙腈-磷酸系统，结果表明甲醇-0.35%磷酸分离效果较好。通过DAD检测器全波长扫描发现木蝴蝶苷B、黄芩苷、肉桂酸和芦丁的最大吸收波长分别为276 nm、280 nm、285 nm、和257 nm，由于黄芩苷含量较低，而且在280 nm处4种成分波长吸收都较好，因此选择280 nm作为最佳检测波长。

由于中成药多数成分复杂，一次实验同时测定几种成分，不仅能够节约成本和实验时间，而且能够实现对药品质量的全面控制。本研究中建立的方法可同时测定咽炎片中4种指标性成分，方法简便高效，结果准确；能够反映出咽炎片中木蝴蝶、玄参和款冬花(制)的投料情况，为咽炎片的质量控制和标准修订提供参考依据。