糖基化反应对乳清蛋白-岩藻多糖共聚物抗氧化性能的影响

艾正文，于 鹏

（光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海乳业生物工程技术研究中心，乳业生物技术国家重点实验室，上海 200436）

乳清蛋白是一种重要的蛋白质，含有大量人体必需氨基酸且易于消化吸收，因此被认为是人体补充优质蛋白质的重要来源之一，成为各国的研究热点。其中，通过对乳清蛋白进行物理、化学或生物改性，进而改变乳清蛋白的某些功能特性的报道不断涌现。

在一定条件下，蛋白质和碳水化合物之间可以发生交联反应，糖基化反应是一种重要的化学反应。在食品加工过程中，糖基化反应普遍发生在加热或产品贮藏过程中。目前，有研究表明，某些糖基化产物具有一定的生物活性[1]。相较于其他蛋白质改性方法，糖基化反应具有安全、绿色等优势，因此受到各国研究人员的青睐

[2]。早在20世纪50年代就有糖基化产物结构和功能的有关研究报道。研究表明，某些糖基化产物（类黑精、杂环化合物等）具有一定的抗氧化活性[3]。Liu Qian等[4]研究表明，蛋白质与葡萄糖经过糖基化反应后得到的糖基化产物与未反应前的蛋白质相比，其抗氧化能力显著增加。

乳清蛋白糖基化反应产物的功能特性与糖基化过程中的碳水化合物种类密切相关。目前，关于乳清蛋白糖基化产物的抗氧化研究已陆续有研究报道[5]。其中，以乳清蛋白与葡萄糖、果糖、麦芽糊精和核糖等碳水化合物的糖基化产物抗氧化性研究居多[6-7]。岩藻多糖作为一种含有硫酸基的大分子多聚糖，由于其潜在的抗氧化、提升免疫力等多种生物活性，最近几年逐渐成为研究热点。然而，目前乳清蛋白与岩藻多糖糖基化产物抗氧化性能的研究仍鲜有报道。本研究通过干法糖基化研究不同比例的乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的抗氧化性能，从而揭示蛋白质和多糖比例以及糖基化反应时间对最终产物抗氧化性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白BiPRO®（纯度≥90%） 美国安格普有限公司；岩藻多糖 北京雷力联合海洋生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 东京仁成工业株式会社；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

ML-T分析天平、FiveGo F2 pH计 瑞士梅特勒-特利多公司；HPP110恒温恒湿培养箱 德国Memmert公司；SP-752紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司；FreeZone真空冷冻干燥机 美国Labconco公司。

1.3 方法

岩藻多糖含量的测定主要参考SC/T 3404—2012《岩藻多糖》[8]所述方法。称取0.1 g岩藻多糖样品于试管中，加入10 mL 4 mol/L三氟乙酸充分混匀，置于110 ℃干燥箱中水解2 h，冷却至室温；加入NaOH调节pH值至中性，用0.1 mol/L磷酸二氢钾缓冲液定容备用；将获得的水解液用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮进行衍生化，然后将衍生化后的样品过膜后进行高效液相色谱分析。流动相A：15%乙腈和85% 0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液；流动相B：40%乙腈和60% 0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液；梯度洗脱；250 nm波长处检测。含量的测定采用BaCl2沉淀法，方法参考Dodgson[9]和SC/T 3404—2012[8]所述方法，并稍作修改。称取适量岩藻多糖样品，加入1 mol/L盐酸，在100 ℃条件下水解4 h，水解液用滤纸过滤；将得到的过滤液煮沸1 min后逐渐加入适量10 g/100 mL BaCl2后再煮沸4 min，最后记录沉淀物的质量，根据式（1）计算的含量。

式中：m1为样品的质量/g；m2为无水BaSO4质量/g；的摩尔质量/（g/mol）；233.39为BaSO4的摩尔质量/（g/mol）。

1.3.2 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物的制备

首先将乳清蛋白和岩藻多糖按照一定质量比溶于蒸馏水中，用乳酸调节至pH 6，然后充分混合均匀后将混合液置于超低温冰箱中冻存12 h，随后将冷冻后的乳清蛋白-岩藻多糖混合液放入冻干机中冻干48 h，制得的乳清蛋白-岩藻多糖冻干粉留存备用。

称取2 g乳清蛋白-岩藻多糖冻干粉，平铺于培养皿中，然后置于相对湿度79%、温度55 ℃的恒温恒湿培养箱中进行糖基化反应，从而获得乳清蛋白-岩藻多糖共聚物。

1.3.3 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物褐变程度的测定

参考Corzo-Martínez等[10]的方法，并略作修改。精确称量0.1 g不同反应时间段的乳清蛋白-岩藻多糖共聚物，用去离子水溶解后定容至100 mL，分别在294、420 nm波长处测定其吸光度（A），若吸光度超过1.5，可对样品进行适当稀释。

1.3.4 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物DPPH自由基清除能力测定

称取1.3.2节不同反应时间段获得的乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物，用去离子水混合均匀后定容至25 mL，配制成质量浓度4 mg/mL的溶液；随后取2 mL与2 mL 0.1 mmol/L DPPH混匀，放置于37 ℃暗室培养箱中反应30 min；最后在517 nm波长处测定吸光度。同时，取适量VC，配制成质量分数0.01%的VC水溶液，在相同条件下测定DPPH自由基清除率，作为对照。根据式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中：Ai为样品和0.1 mmol/L DPPH混合液（1∶1，V/V）的吸光度；At为样品和无水乙醇混合液（1∶1，V/V）的吸光度；A0为无水乙醇和0.1 mmol/L DPPH混合液（1∶1，V/V）的吸光度。

1.3.5 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物还原能力测定

称取1.3.2节不同反应时间段获得的乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物，用去离子水混合均匀后定容至25 mL，配制成质量浓度4 mg/mL的溶液。还原能力测定参考张加幸等[11]的方法。

1.4 数据处理

采用Excel和Origin 8.5软件对数据进行分析和处理，采用SPSS 19.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 岩藻多糖样品的岩藻多糖和含量

本研究使用的岩藻多糖样品是通过水提方法从海带（Laminaria japonica）中提取获得的。经高效液相色谱和BaCl2沉淀法对样品中的岩藻多糖和含量分别进行测定。

表 1 岩藻多糖样品中岩藻多糖和含量及pH值Table 1 pH value, purity and content of fucoidan

表 1 岩藻多糖样品中岩藻多糖和含量及pH值Table 1 pH value, purity and content of fucoidan

注：*.岩藻多糖水溶液质量浓度为1 g/100 mL。

2-含量/% pH*测定结果 85.6 24.5 6.45指标 岩藻多糖含量/% SO4

2.2 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物的褐变程度

随着糖基化反应进程的进行，反应体系的颜色会发生不同程度的改变，通过对糖基化反应过程中早期阶段产物（A294nm）和高级阶段产物（A420nm）的吸光度进行测定，可以反映体系的褐变程度，进而得知糖基化反应的进程[12]。

表 2 乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的褐变程度（n=3）Table 2 Degree of browning in glycosylated whey protein with fucoidan (n= 3)

由表2可知，大部分样品随着糖基化反应时间的延长，其褐变程度总体上呈逐渐增加趋势，特别在反应前期阶段（60 h），褐变程度呈现显著增加（P＜0.05）。在294 nm波长处检测时，乳清蛋白与岩藻多糖质量比为1∶2时，糖基化产物的褐变程度（A294nm）从0 h时的1.040显著增加到90 h的1.417（P＜0.05）；乳清蛋白与岩藻多糖质量比为3∶1时，糖基化产物的A294nm在80 h时达到最大，随后在反应到90 h时有轻微下降。同样，在420 nm波长条件下，糖基化反应时间能够显著影响整个反应体系的褐变程度（A420nm），4 组样品的A420nm从0 h到90 h均增加超过30%，其中前3 组样品与未反应前相比，A420nm增加率超过50%。当乳清蛋白与岩藻多糖质量比为3∶1时，样品在反应80 h时A420nm达到最大，随后没有发生显著变化（P＞0.05），这与A294nm的变化趋势基本一致。

蛋白质糖基化是蛋白质的非酶促不可逆羰基修饰，一般可分为3 个过程，即早、中、晚3 个阶段[13]，随着反应的进行，整个体系的颜色逐渐加深。通过A294nm和A420nm的比值（A294nm/A420nm）可以监测不同阶段的糖基化产物对整个体系褐变程度的贡献情况[14]。在相同糖基化条件下，反应底物中岩藻多糖含量越低，体系进入糖基化进程中后期的时间越早。杜玲玲等[15]研究发现，褐变程度与蛋白质和碳水化合物的接枝度具有良好的对应关系。4 组样品在420 nm波长处的吸光度在90 h时达到最大，样品褐变程度达到最大。此外，与其他组不同的是，第4组样品60～80 h的A420nm没有发生显著变化。原因一方面可能是底物岩藻多糖比例的增加会延缓糖基化反应的速率；另一方面，可能是由于糖基化早期阶段产物在紫外区间吸收量较低[16]。

2.3 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物的DPPH自由基清除能力

通过对糖基化产物的DPPH自由基清除能力进行测定，判断乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物的抗氧化性能。

图 1 乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的DPPH自由基清除能力Fig. 1 DPPH radical scavenging activity of the whey protein and fucoidan glycosylation products

由图1可知，对于单独的乳清蛋白或岩藻多糖底物，在现有的糖基化条件下，随着时间的延长，其DPPH自由基清除率无明显变化（P＞0.05）。在糖基化反应开始后，乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的DPPH自由基清除率显著高于单独的乳清蛋白或岩藻多糖（P＜0.05），而且随着反应的推进，各糖基化产物的DPPH自由基清除率也基本呈逐渐增加趋势。乳清蛋白与岩藻多糖质量比为3∶1时，其糖基化产物在反应90 h时的DPPH自由基清除率相比0 h时增加超过30%。在相同反应条件下，混合反应底物中的岩藻多糖含量越高，其糖基化产物的DPPH自由基清除能力相对越强。当乳清蛋白与岩藻多糖质量比为1∶3时，其糖基化产物的DPPH自由基清除率在反应80 h时达到最大（74.28%），显著高于相同时间下的乳清蛋白（40.68%）和岩藻多糖（51.42%），但是仍低于对照组（0.01% VC）。研究表明，岩藻多糖分子结构和SO42-基团含量对抗氧化活性有较为明显的影响[17]，糖基化反应产生的蛋白多糖可能会增强岩藻多糖的抗氧化性能。此外，乳清蛋白与岩藻多糖质量比为1∶3时，其糖基化产物在反应90 h时的DPPH自由基清除率有一个明显的下降过程，但是其在90 h时的A420nm却显著增加（表2），由此说明，进入糖基化反应后期，产物的褐变程度与自由基清除能力不一定呈正比关系。

2.4 乳清蛋白-岩藻多糖糖基化产物的还原能力

还原力作为评价物质抗氧化性能的另一个重要指标，通常以该物质在700 nm波长处的吸光度（A700nm）表示。A700nm值越大，物质的还原能力越强[18]。

图 2 乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的还原能力Fig. 2 Reducing power of the whey protein and fucoidan glycosylation products

由图2可知，乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的还原能力随着加热时间的延长显著增加，而当反应底物中只含有乳清蛋白或岩藻多糖时，A700nm则随糖基化反应时间的延长无明显变化，这说明乳清蛋白和岩藻多糖通过糖基化反应能产生具有还原能力的物质[19]。这些具有还原能力的物质可能来源于糖基化反应中后期阶段产生的还原性酮和类黑精等物质[20]。张加幸等[11]研究表明，岩藻多糖本身具有一定的还原力，这与本研究结果相符，但是岩藻多糖的还原力与其多糖组成和结构密切相关。高强度、长时间的糖基化反应可能会破坏其特定结构，从而造成糖基化产物还原力的降低。

3 结 论

通过干法糖基化制得乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物，并对不同反应时间糖基化产物的褐变程度、DPPH自由基清除率及还原力进行测定。结果表明，糖基化反应能显著提高乳清蛋白和岩藻多糖单体的抗氧化性能，随着反应时间的延长，糖基化产物的抗氧化性能呈现逐渐增加趋势，但是反应产物的褐变程度与DPPH自由基清除率不完全呈正比关系。同等条件下，反应底物中的岩藻多糖含量越高，其糖基化产物的抗氧化性能越强。虽然目前乳清蛋白和岩藻多糖糖基化产物的抗氧化性仍低于传统抗氧化物质，但是目前的研究仍处于初步阶段，其潜在的功能仍具有一定的研究价值。