小鼠不同生长阶段骨骼肌组织中Myf5 的表达

冀云燕，薛霖莉，2，曹 靖，李艺雷，任华伟，罗小毛，于秀菊，赫晓燕，耿建军

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801；2.山西农业大学信息学院，山西太谷030800；3.北京农业职业学院畜牧兽医系，北京102442）

肌源性因子5（Myogenic factor 5，Myf5）是肌源性调节因子家族成员，是骨骼肌调节基因[1]，负责脊椎动物胚胎的骨骼肌生成[2]，在骨骼肌形成初期对肌原细胞增殖分化起主要作用[3]，与肌原性分化密切相关[4]。

DUPREZ 等[5]研究发现，Myf5 可以在体外迫使非肌肉细胞中的肌原性转化，Myf5 表达与成肌细胞增殖相关。KURYL 等[6]研究认为，Myf5 基因对于猪屠体瘦肉的含量和眼肌肉的面积都具有非常重要的影响。LIU 等[7]研究发现，在大白猪×梅山猪的F2群体之中，Myf5 基因的Hsp9211 位点对猪背最长肌的肌间脂肪（P＝0.04）和吸水力都有非常明显的影响（P＝0.000 1）。孙文浩[8]对鸡的研究表明，Myf5基因的单倍型组合对于鸡的胸肌质量、腿肌质量、活体质量、屠体质量具有非常明显的影响（P＜0.05），而且Myf5 基因单倍型组合也对肌纤维的密度以及肌纤维的直径都有显著影响（P＜0.05）。BEAUCHAMP[9]研究发现，Myf5 的表达与骨骼肌卫星细胞密切相关，Myf5 缺失小鼠表现出在冻伤后肌纤维肥大，延迟分化，脂肪细胞积聚和纤维化显著增加[10]，缺乏Myf5 小鼠不能形成成肌细胞[11]。FRIDAY 等[12]研究发现，Myf5 在骨骼肌的测定、发育和分化中起重要作用，在卫星细胞被激活时最先表达Myf5[13]，Myf5 能够将许多非肌肉细胞转化为肌肉[14]。

本试验通过研究Myf5 基因在小鼠不同发育阶段骨骼肌组织中的表达情况，探索其在小鼠骨骼肌组织表达的规律，旨在揭示骨骼肌生长发育的调控机制，为后续Myf5 基因的功能研究以及肌肉疾病的预防、治疗提供相关理论依据

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 共选取16 只健康小鼠，即幼龄小鼠（7 日龄）、性成熟小鼠（21～28 日龄）、体成熟小鼠（42～56 日龄）和老龄小鼠（84 日龄以上）各4 只，均由山西农业大学试验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂与仪器 氯仿、异丙醇、无水乙醇（天津天大化工）、RNAisoPlus、PrimeScriptTMRTreagent Kit（Perfect Real Time）、SYBR PremixExTap（Takara）、Myf5 抗体（三鹰）、β-actin（三鹰）等；高压蒸汽灭菌器（Sabyo 公司）；光学显微镜（Leica 公司）、普通MYF5 仪（Bio-Rad 公司）、Mx3000P 实时荧光定量PCR 仪及相应的检测软件（Agilent）、高速冷冻离心机（Sigma 公司）、凝胶成像仪（Panasonic 公司）、超净工作台（SW-CJ-CO 型，苏州市华宇净化设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 取材 通过断颈使小鼠安乐死，将小鼠用70%酒精彻底喷洒（以防止小鼠皮毛污染），用镊子拾起腹部皮肤，然后用锋利的剪刀做一个纵向切口，沿相反方向剥去皮肤，沿胫骨两侧插入和延伸剪刀，切除腓肠肌，分为2 份，一份快速放入液氮速冻，一份放入固定液固定。

1.2.2 引物设计与合成 试验所用引物均根据GenBank Myf5 基因对应（登录号：17877）的小鼠序列，采用Premier 5.0 软件进行实时荧光PCR 引物设计，由北京华大公司合成（表1）。

表1 引物序列信息

1.2.3 普通PCR 扩增 以小鼠骨骼肌cDNA（100 ng/μL）为模板，10 μL 体系进行普通PCR 扩增：2×Taq Master Mix 5 μL，待测上游引物0.4 μL，待测下游引物0.4 μL，cDNA 100 ng，ddH2O 补足10 μL。PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，梯度退火温度30 s，72 ℃延伸20 s，35 个循环；72 ℃终止延伸5 min。产物进行1%琼脂凝胶电泳。

1.2.4 实时荧光定量PCR 以小鼠骨骼肌cDNA（100 ng/μL）为模板，10 μL 体系进行实时荧光定量PCR：SYBR Premix Ex Taq（2×）5 μL，待测基因上游引物0.4 μL，待测基因下游引物0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ0.2 μL，CDNA 100 ng，ddH2O 补足10 μL。实时荧光定量PCR 扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，35 个循环。用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.5 组织包埋、石蜡切片制作及HE 染色Bouins 固定脱蜡，梯度酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡、包埋，凝固后4 ℃长期保存。石蜡切片去5 μm厚，常规HE 染色后使用中性树脂封片。用显微镜观察组织不同发育阶段形态学差异。

1.2.6 免疫组织化学分析 脱蜡、封闭内源性过氧化物酶与阻断异性抗原、滴加已稀释一抗（4 ℃过夜），滴加二抗（37 ℃30 min），显色、复染、脱水与封片、镜检。

2 结果与分析

2.1 小鼠不同生长时期骨骼肌的组织形态学变化

从图1 可以看出，幼龄小鼠的细胞核多位于细胞边缘，肌纤维的横切面近似圆形；性成熟、体成熟小鼠的肌纤维多排列致密，呈簇排列，胞核多位于周边，肌纤维的横切面近似多边形；老龄小鼠肌纤维排列松散，肌束间间隙增大。表明从幼龄到体成熟阶段，随着年龄的不断增加，肌纤维在不断生长，肌纤维的直径不断增加，肌纤维的横切面由近似圆形逐渐变为多边形，肌束排列更加紧密；而在老龄阶段，肌束间的间隙逐渐增大。

2.2 小鼠不同生长时期骨骼肌中Myf5 的表达

由图2 可知，阳性组和阴性组明显不同，阴性组细胞核呈现蓝色，胞质为淡粉色。表明Myf5 的表达定位于细胞核中，Myf5 在幼年、体成熟、性成熟、老年小鼠的4 个不同发育阶段的骨骼肌中均有表达，且免疫组织化学结构染色深浅不一，阳性组幼龄阶段着色较深。表明Myf5 在幼年阶段的表达量较多，而在性成熟、体成熟、老年阶段的表达量相对较少。

2.3 Myf5 基因在小鼠不同生长时期骨骼肌中的表达

为了选出Myf5 基因的最佳退火温度，在PCR 扩增过程中设置温度梯度54.0～61.0 ℃，中央57.5 ℃，跨度7.0 ℃，根据扩增的产物进行琼脂凝胶电泳。由图3 可知，产物片段为172 bp，第3 泳道无杂带，而且清晰明亮，没有拖尾现象。因此，最适的退火温度为57.5 ℃。

2.4 Myf5 mRNA 在小鼠不同生长时期骨骼肌中的表达变化

由图4，5 可知，扩增溶解曲线基线单一，基本平直，无明显的上扬趋势，说明定量的曲线符合预期，可以用于试验。按照试验过程中的定量结果，应用统计学的方法对试验数据进行处理，并绘制图6，结果显示，Myf5 mRNA 在小鼠4 个不同发育阶段均有表达，但表达存在差异性。幼年小鼠、性成熟小鼠、体成熟小鼠的Myf5 mRNA 表达极显著低于老年小鼠（P＜0.001），Myf5 mRNA 的表达量与小鼠的生长发育阶段有一定的相关性。

3 结论与讨论

肌源性因子5 是一种人体内由Myf5 基因编码的蛋白质[15]，在调节肌肉分化或肌生成，特别是骨骼肌的发育中发挥关键作用[16-17]。Myf5 在肌源性分化中起着重要作用[18]。此外，Myf5 是肌肉发育的主要调控因子，在成纤维细胞中表达时，具有诱导肌肉表型的能力[19]。研究发现，Myf5 在早期体细胞的皮肌组中表达，能促使肌源性前体分化为成肌细胞[20]，肌生成方面发挥作用的同时，也间接控制了近端肋骨的发育与骨骼肌再生[21-23]。Myf5 是卫星细胞的关键细胞标志物之一，在肌肉损伤再生中起着重要作用[24]，当肌肉发生损伤时，处于静止状态的卫星细胞被激活，通过增殖、分化后重新形成新的骨骼肌细胞，从而实现骨骼肌损伤修复[25]。

SMITH 等[26]研究发现，Myf5 在不同阶段均有表达。BRAUN 等[27]研究发现，Myf5 是成肌特化的主要调节因子，其不仅决定了成肌细胞的早期命运，而且也在成肌细胞的早期分化中起着重要的作用，Myf5 与失神经骨骼肌萎缩的发生有关。本试验探究Myf5 在不同发育阶段小鼠骨骼肌的表达定位，结果显示，Myf5 在小鼠的不同发育阶段骨骼肌上均有表达，但表达量各有不同，其中，幼年、性成熟、体成熟小鼠中Myf5 表达量显著低于老年小鼠。表达量与小鼠心肌细胞的发育具有相关性。曹婷等[28]对五指山猪的研究表明，在出生后的五指山猪的背部肌肉组织中的表达水平与其生长的年龄成正比（P＜0.05）。魏园丁等[29]对鸭胸肌的研究显示，胸肌和腿肌中Myf5 的表达量分别在27，14 胚龄达到高峰随后缓慢降低。张涛等[30]对京海黄鸡的研究发现，Myf5 基因在幼龄时期表达量最高，随着年龄增长呈下降趋势。在损伤的情况下细胞周期激活，这可能是因为Myf5 基因突变型导致数量增加的原因，且不能排除Myf5 基因的积累，是造成小鼠骨骼肌Myf5 表达在老年期高的原因。