超声波辅助提取绣球菌麦角甾醇的工艺优化

耿雪冉，张巧毅，常明昌，孟俊龙，徐丽婧，程艳芬，王术荣

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801；2.黄土高原食用菌提质增效协同创新中心，山西太谷030801；3.湖南农业大学东方科技学院，湖南长沙410128）

麦角甾醇，也称为麦角固醇，是维生素D2的前体，是高等真菌类特征性的甾醇[1]。近年来，对食用菌麦角甾醇的提取和生理功能的报道越来越多。WEI 等[2]用甲醇提取猴头菇中的麦角甾醇，发现其能够通过抑制NO 的产生、抑制细胞因子TNF-α 的释放而发挥抗炎症的功效。根据文献报道，食用菌麦角甾醇（牛樟芝[3]、灵芝[4]、桦褐孔菌[5]、冬虫夏草[6]、虎奶菇[7]、黑虎掌[8]等）的抗炎症作用机制基本上都是抑制NO 的产生和减少细胞因子的释放[9]。HU等[10]研究发现，榆黄蘑子实体中提取的麦角甾醇能显著降低高血脂大鼠血清胆固醇水平，并且有抗氧化作用。食用菌麦角甾醇还有抗肿瘤、增强免疫力、利尿等生理功能[11-12]。

绣球菌（Sparassis crispa）是担子菌门伞菌纲非褶孔菌目绣球菌科绣球菌属的一种食药用大型真菌，因其独特的口感和高含量的功能性β- 葡聚糖（β-1，3 葡聚糖）而被人们广泛关注[13]。绣球菌富含多种具有药理活性的物质，如酚类物质、多酚、类黄酮、萜类物质、甾醇类物质、活性多糖等。这些生理活性物质经现代药理研究表明，赋予绣球菌抗肿瘤、抗血管生成、防止癌细胞转移、抗菌、抗病毒、降血压、降血糖和抗过敏等药用作用[14-20]。常见的麦角甾醇检测方法有UV 法、各种类型的高效液相色谱仪法、多波长法等，高效液相色谱法对仪器、实验员技能的要求高。目前，食用菌中麦角甾醇的提取方法大多比较繁琐，采用超声波提取的方法相对简便，耗时短，而且提取率有保障。

本研究建立了一种采用UV 法快速检测绣球菌麦角甾醇含量的简便方法，并进行了优化，为绣球菌进一步开发利用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

供试绣球菌由山西农业大学食品科学与工程学院食用菌实验室提供。

麦角甾醇标准品购自北京索来宝科技有限公司，甲醇色谱纯。其他未特殊说明试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 绣球菌麦角甾醇的提取方法 将新鲜采集的绣球菌去其根部约1.5 cm，冷冻干燥之后用粉碎机粉碎过筛，密封袋密封，4 ℃遮光保存备用。

取上述子实体粉末1 g，用提取剂浸提，超声波振荡提取，抽滤，将上清液在旋转蒸发仪蒸干，再用三氯甲烷溶解后，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，上清即为绣球菌麦角甾醇提取液。

1.2.2 麦角甾醇检测方法的建立

1.2.2.1 麦角甾醇标准曲线的制作 准确称量0.1 g麦角甾醇标准品，用三氯甲烷溶解，定容至100 mL，得麦角甾醇标准品母液，其质量浓度为100 μg/mL。用配制的麦角甾醇标准品母液制备一系列质量浓度梯度为5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg/mL的标准液。所有标准溶液于-20 ℃避光保存。

将麦角甾醇标准品分别在271，280.08，282，292 nm 处检测吸光值。在最适吸光值处检测不同质量浓度的麦角甾醇标准品溶液，以麦角甾醇质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2 精密度试验 取待测样品溶液，于292 nm波长下重复测定5 次，记录结果，判断该方法和该紫外分光光度计的精密度。

1.2.2.3 稳定性试验 取待测样品溶液，分别在0，2，5，9，15，24 h 于292 nm 检测，验证该提取液在一天之内的稳定性。

1.2.2.4 重复性试验 准确称取5 份1 g 的绣球菌粉末，按照1.2.1 的方法制备绣球菌麦角甾醇提取液，用该方法检测麦角甾醇的提取率，验证该方法的重复性。

1.2.3 绣球菌麦角甾醇提取单因素试验

1.2.3.1 提取剂的确定 准确称取1 g 绣球菌粉末，分别用25 mL 的甲醇、丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷4 种提取剂采用超声波振动抽提60 min，抽滤，将上清液在旋转蒸发仪蒸干，再用三氯甲烷溶解后12 000 r/min，4 ℃离心10 min，检测不同提取剂麦角甾醇的含量，以确定最佳的提取剂。

1.2.3.2 超声波振动时间的确定 准确称取绣球菌粉末1 g，用25 mL 三氯甲烷提取，分别用超声波振动20，40，60，80，100，120 min，抽滤后12 000 r/min，4 ℃离心10 min，测定不同超声波振动时间麦角甾醇的含量，以确定最佳超声波振动时间。

1.2.3.3 料液比的确定 准确称取绣球菌粉末1 g，分别用5，10，15，20，25 mL 三氯甲烷提取，超声波振动60 min，抽滤后12 000 r/min，4 ℃离心10 min，测定不同料液比麦角甾醇的含量，以确定最佳料液比。

1.2.4 绣球菌麦角甾醇提取工艺的优化 在提取剂、超声波振动时间和料液比3 个单因素试验的基础上，选取3 个适宜的水平，设计L9（33）正交试验，以确定最佳的提取工艺。

2 结果与分析

2.1 麦角甾醇检测方法的建立

2.1.1 麦角甾醇标准曲线的制作 麦角甾醇在紫外线波长范围内271，280.8，282，292 nm 处都能检测到明显的吸收峰。本试验所用的麦角甾醇标准品，在292 nm 处的吸光值为0.437，与282 nm 处的吸光值0.475 相差不大（表1）。虽然在282 nm 处显示最高吸收峰，但是由于本试验所用的绣球菌粉末在282 nm 处有杂质的干扰，而在292 nm 处杂质的干扰较小，因此，本试验采用292 nm 为麦角甾醇的最佳检测波长。

表1 几种检测波长的比较

将一系列浓度梯度为5，10，15，20，25，30，35，40，45，50 μg/mL 的麦角甾醇标准液分别在292 nm处检测吸光值，以麦角甾醇标准品质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线（图1）。在线性范围5.00～50.00 μg/mL 内，得到线性回归方程y＝0.027x＋0.013 5（R2＝0.994 5）。说明在一定的数值范畴内，麦角甾醇标准品的质量浓度与吸光值呈线性关系。

2.1.2 UV 检测方法的精密度 在精密度试验中，待测样品于292 nm 波长下重复测定5 次的吸光值分别为0.361，0.360，0.362，0.359 和0.361，对应的麦角甾醇含量分别为2.610，2.601，2.619，2.592，2.610 μg/mL，相对标准偏差RSD（n＝5）为0.01%（表2），说明该紫外分光光度计的精密度良好。

表2 精密度试验结果

2.1.3 UV 检测方法的稳定性 将待测绣球菌麦角甾醇提取液分别在0，2，5，9，15，24 h 于292 nm 处检测其吸光值（表3），相对标准偏差为0.06%，证明绣球菌麦角甾醇提取液在一天之内用该方法测定的结果稳定性良好。

表3 稳定性试验

2.1.4 UV 检测方法的重复性 按照1.2.2.4 的方法进行重复性验证，测得麦角甾醇的平均含量为2.553 mg/g（表4），相对标准偏差RSD 为1.11%，证明采用该方法测定绣球菌麦角甾醇含量的重复性良好。

表4 重复性试验结果

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 提取剂的确定 4 种提取剂甲醇、丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷提取绣球菌麦角甾醇的含量列于表5。由表5 可知，三氯甲烷提取效果最好，其次是丙酮和甲醇，乙酸乙酯的提取效果最差。最终确定绣球菌麦角甾醇的最佳提取剂为三氯甲烷。甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮等有机溶剂都可以用来提取麦角甾醇。食用菌种类不同，麦角甾醇的最佳提取剂也不同。刘京晶等[21]在测定灵芝子实体中麦角甾醇含量时采用乙醇作为提取溶剂。无水乙醇也是采用超声波辅助法提取金针菇中麦角甾醇的最佳提取溶剂[22]。然而，栗铭鸿等[23]在鸡枞菌不同溶剂提取物成分分析及抗氧化作用研究中发现，甲醇对鸡枞菌麦角甾醇的提取率最高。在本研究中，三氯甲烷是采用超声波辅助法提取绣球菌麦角甾醇的最佳提取剂。

表5 不同溶剂提取麦角甾醇吸光值的比较

2.2.2 超声波处理时间的确定 在不同的超声波振动时间（20，40，60，80，100，120 min）提取得到的绣球菌麦角甾醇的含量各不相同（表6）。随着超声波振动处理时间的加长，麦角甾醇的提取率处于缓慢上升的状态，于60，80，100 min 处，每毫升所含的麦角甾醇量较高，各水平之间差异不明显。因此，确定超声波处理时间为60，80，100 min。

2.2.3 料液比的确定 以三氯甲烷作为提取剂，超声波振动时间为60 min 的条件下，使用不同的料液比提取绣球菌的麦角甾醇（表7）。当三氯甲烷体积由5 mL 增加到15 mL 时，甾醇提取量之间有较大差异。当三氯甲烷体积为15 mL 时，提取得到的麦角甾醇量最多。因此，当绣球菌粉末为1 g 时，确定三氯甲烷的最佳提取体积为15 mL。

表6 不同振动时间提取麦角甾醇吸光值的比较

表7 不同浸提比提取麦角甾醇吸光度的比较

2.3 最佳提取工艺的优化

根据单因素试验结果，以提取溶剂、料液比、超声波提取时间作为影响绣球菌麦角甾醇提取量的因素，以3 因素3 水平进行正交试验对提取条件进行优化。正交试验设计列于表8，正交试验结果列于表9。

表8 正交试验的因素及水平

表9 正交优化试验结果分析

由表9 可知，对绣球菌麦角甾醇提取量影响的因素按先后顺序依次为：提取剂（A）＞超声波提取时间（C）＞料液比（B）。正交优化得出的最优提取条件是：A3B3C2，即提取溶剂为三氯甲烷，料液比为1∶20（g/mL），超声波提取时间为80 min。

3 结论与讨论

食用菌营养丰富，被誉为“21 世纪的健康食品”[24]。食用菌产业是我国现代农业的一个重要组成部分，发展迅猛，也是一个极具发展前景的新兴产业[25]。人们对食品的需求层次越来越高，食用菌作为副食走进了大众的餐桌[26]。绣球菌不仅是一种美味的食用菌，并且无论是在传统医学还是现代医学的探索中，都有对绣球菌活性物质药理学功效的研究。然而多数学者的关注点都是绣球菌多糖，对绣球菌小分子物质尤其是麦角甾醇的研究很少。麦角甾醇具有独特的生理作用，并且在药物开发中也被广泛应用。

本试验建立了UV 法快速检测绣球菌麦角甾醇含量，其精密度、稳定性和重复性都表现良好。并且采用正交试验的方法优化超声波辅助提取绣球菌麦角甾醇，确定的最佳提取工艺条件为：以三氯甲烷为提取剂，料液比1∶20（g/mL），超声波振动提取时间80 min，此条件下得到的麦角甾醇含量最高。