柴芍六君汤对慢性乙型肝炎肝郁脾虚证患者肝纤维化相关指标改善作用以及血清Treg/Th17比率变化的影响*

柏文婕,石清兰，毛德文,吕 超

(1.广西中医药大学,南宁 530200； 2. 广西中医药大学第一附属医院肝病科,南宁 530023)

乙型肝炎病毒(HBV)通过直接损伤、炎性反应等途径可使肝脏发生纤维化[1]。肝纤维化是乙型肝炎发展为肝硬化甚至肝癌之前的一种可逆转性病理过程，对早期肝纤维化进行治疗是降低肝硬化、肝癌发生的有效途径之一[2]。现代医学治疗慢性乙型肝炎肝纤维化主要采取核苷类似物、干扰素、保肝类药物等，但抗肝纤维化的疗效仍有待提高，且副作用较大[3]。中医药对肝纤维化具有多环节、分阶段、多靶点的药理学效应[4]。慢性乙肝属于中医学“黄疸”“胁痛”等范畴，肝郁脾虚为其常见证候，主要表现为肝气郁结不畅、肝病及脾，致脾气耗损，治宜疏肝健脾[5]。柴芍六君汤为《医学正传》古方六君子汤加柴胡、白芍而成。文献报道，柴芍六君汤可改善肝郁脾虚型慢性乙型肝炎患者的症状，减轻蛋白尿，对肝功能有一定的保护作用[6]。本课题组在西医常规疗法基础上采取柴芍六君汤治疗慢性乙型肝炎肝郁脾虚证肝纤维化患者53例，并与同期单纯西医常规治疗的48例患者进行对照观察，并探讨其可能的作用途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2018年10月广西中医药大学第一附属医院肝病科收治的慢性乙型肝炎肝纤维化患者106例，按随机数字表法分为观察组和对照组各53例。本组患者的依从性好，未发生脱落病例。对照组男性31例，女性22例；年龄40～49岁，平均年龄(44.31±5.57)岁；病程15～41个月，平均病程(30.40±3.99)个月；丙氨酸氨基转移酶(ALT)(165.93±18.33)U/L。观察组男性33例，女性20例；年龄39～46岁，平均年龄(43.91±5.82)岁；病程17～40个月，平均病程(29.71±3.81)个月；ALT(165.77±18.51)U/L。2组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已获得广西中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 纳入标准 慢性乙型肝炎诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》[7]标准，肝纤维化诊断符合《肝纤维化中西医结合诊疗指南》[8]标准，肝郁脾虚证诊断符合《慢性乙型肝炎中医诊疗指南(2018年版)》[9]标准。主症：胁肋胀痛；腹胀便溏。次症：纳呆食少；身倦乏力；舌质淡有齿痕。20岁≤年龄≤60岁。乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)均阳性，且HBV-DNA复制数>103拷贝/mL；患者或家属签署知情同意书。

1.2.2 排除标准 合并心脑血管、肺、肝肾等系统严重障碍；肝炎后肝硬化失代偿期，或重型慢性乙型肝炎者；精神病者；停用抗病毒治疗未达6个月及以上者；合并药物性肝炎、酒精性肝病以及其他慢性肝病者；同时合并甲、丙、戊、丁型肝炎病毒者；伴恶性肿瘤者；合并其他中医证型者。

1.3 治疗方法

基础治疗采取恩替卡韦分散片(苏州东瑞制药有限公司，批准文号H20100129)口服治疗，每次0.5 mg，每日1次。对照组给予中药安慰剂(由玉米粉、焦糖色和苦味剂等组成)治疗，该安慰剂无效、无毒，且在外观、颜色以及气味等方面基本与柴芍六君汤一致，服用方法与柴芍六君汤相同。观察组采取柴芍六君汤内服：党参 15 g，白术 10 g，茯神 30 g，炙甘草 9 g，陈皮10 g，半夏 5 g，柴胡5 g，白芍30 g；药物饮片均来自本院药学部制剂室，由全自动中药煎药机统一煎制成口服液，每日1 剂，水煎至约200 mL，分早晚2 次温服，2组患者疗程均为24周。

1.4 观察指标

1.4.1 2组肝郁脾虚证症状评分 参见《慢性乙型肝炎中医诊疗专家共识》[10]按4级评价患者的胁肋胀痛、腹胀、便溏、纳呆食少、身倦乏力，分别评分为无(0分)、轻度(2分)、中度(4分)、重度(6分)，在治疗前及治疗结束后各测评1次。

1.4.2 2组肝功能 晨起患者空腹下抽取外周血3 mL，离心取血清于-70 ℃待测；使用全自动生化分析仪测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、γ-谷氨酸酰基转移酶(GGT)水平，在治疗前及治疗结束后测定1次。

1.4.3 2组肝纤维化 采集血清同上，采取化学发光分析仪(迈瑞Mindray，CL-2000i)测量透明质酸(HA)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏蛋白(LN)水平；HA试剂盒由博奥赛斯生物科技有限公司提供(批号津食药监械字2012第2400049号)，PCⅢ试剂盒由博奥赛斯(天津)生物科技有限公司提供(批号津食药监械(准)字2012第2400048号)，Ⅳ-C由北京热景生物技术有限公司提供(批号京药监械字2011第2400189号)，LN由上海劲马生物科技有限公司提供(批号FR-A-080)。

1.4.4 2组HBV标志物及定量 采用酶联免疫吸附法检测HBsAg、HBeAg，试剂盒由英科新创科技有限公司提供。主要步骤：将100 μL待测样品37 ℃处理1 h，蒸馏水稀释30倍备用，每孔加洗涤液 30 s后，重复3次，拍干；每孔加酶标抗体100 μL，37 ℃处理，洗涤；显色、终止反应；在酶标仪上以450 nm波长依次测量各孔的吸光度(A值)。PCR法检测HBV-DNA载量，HBV-DNA复制数<103拷贝/mL为阴性，试剂盒由广州中山大学达安基因有限公司提供(批号20140307)。主要步骤：PCR扩增，产物分析，记录仪器分析未知标本数值(M)。

1.4.5 2组外周血调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)比率 Th17细胞检测：常规取静脉血，肝素抗凝并悬浮细胞，将细胞悬液加于血液等量的淋巴细胞分离液上，梯度离心法分离外周血单个核细胞，制成细胞悬液，加入PMA、离子霉素刺激4 h，加入蛋白转运抑制剂； FITC-CD4 抗体处理、洗涤，固定液孵育、洗涤，Alexa Fluor647-IL-17 抗体孵育20 min、洗涤。Treg细胞检测：取静脉血和制作细胞悬液同上，FITC-CD4 抗体处理后洗涤细胞，加入固定液、破膜液孵育， PE-Foxp3 抗体孵育20 min，洗涤重悬细胞；上流式细胞仪(FC-500型，美国贝克曼库尔特公司)检测。

1.5 疗效判断标准[11]

显效：肝郁脾虚证症状评分减少≥70%，血清肝功能基本正常，肝纤维化指标至少2项较治疗前下降≥50%或恢复正常；有效：肝郁脾虚证症状评分减少≥30%但<70%，血清肝功能指标改善，血清肝纤维化指标≥2项测定值较治疗前下降≥25%但<50%；无效：肝郁脾虚证症状评分减少<30%，肝功能指标无明显改善，血清肝纤维化指标未见好转。总有效率=(显效+有效)例数/总例数。肝郁脾虚证症状评分=(治疗前评分-治疗后评分)/治疗前评分。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 2组肝郁脾虚证症状评分比较

表1显示，2组治疗24周后患者的肝郁脾虚证症状(胁肋胀痛、腹胀、便溏、纳呆食少、身倦乏力)评分均显著减少(P<0.01)；治疗24周后，观察组患者上述症状评分显著少于对照组(P<0.01)。

表1 2组肝郁脾虚证症状评分比较(分，

注：与本组治疗前比较：##P<0.01；与对照组治疗后比较：△△P<0.01

2.2 2组肝功能比较

表2显示，2组治疗24周后患者的AST、ALT、TBIL、GGT水平显著降低(P<0.01)；观察组治疗24周后AST、ALT、TBIL、GGT水平明显低于对照组(P<0.01)。

表2 2组肝功能比较

注：与本组治疗前比较：##P<0.01；与对照组治疗后比较：△△P<0.01

2.3 2组肝纤维化指标比较

表3显示，2组治疗24周后患者的肝纤维化(HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN)明显降低(P<0.01)；观察组治疗24周后患者的上述肝纤维化指标均显著低于对照组(P<0.01)。

表3 2组肝纤维化指标比较

注：与本组治疗前比较：##P<0.01；与对照组治疗后比较：△△P<0.01

2.4 2组临床疗效比较

表4显示，治疗24周后观察组总有效率(90.57%)明显高于对照组(73.58%)(P=0.043<0.05)。

表4 2组临床疗效比较[例(%)]

注：与对照组比较：χ2=4.104，*P<0.01

2.5 2组HBsAg、HBeAg、HBV-DNA转阴率比较

表5显示，治疗24周后观察组的HBsAg转阴率(75.47%)、HBeAg转阴率(47.17%)、HBV-DNA转阴率(77.36%)分别明显高于对照组HBsAg转阴率(50.94%)、HBeAg转阴率(26.42%)、HBV-DNA转阴率(54.72%)。

表5 2组HBsAg、HBeAg、HBV-DNA转阴率比较[例(%)]

2.6 2组外周血Treg/Th17细胞比率比较

表6图1显示，2组治疗24周后患者的外周血Th17细胞、Treg细胞以及Treg/Th17比率显著减少(P<0.01)；观察组治疗24周后外周血Th17细胞、Treg细胞以及Treg/Th17比率明显少于对照组(P<0.01)。

表6 2组外周血Treg/Th17细胞比率比较

注：与本组治疗前比较：##P<0.01；与对照组治疗后比较：△△P<0.01

注：A、B：Treg细胞治疗前(A)和治疗后(B)变化，其中右上象限表示Treg细胞百分率;C、D：Th17细胞治疗前(C)和治疗后(D)变化，其中右上象限表示Th17细胞百分率。图1 慢性乙型肝炎患者治疗前后外周血中Th17/Treg细胞百分率比较

3 讨论

慢性乙型肝炎病位在肝，与脾胃联系密切，肝为木，主疏泄，性喜条达而恶抑郁；脾为土，主运化；肝气郁结易招木旺乘土。肝郁脾虚是临床常见病机之一[12]。《素问·至真要大论篇》指出：“木之胜也，土湿受邪，脾病生焉”。由于乙肝病毒侵犯，引起肝气郁结不畅，郁怒伤肝，肝失调达，横乘脾土，继而肝病及脾，同时病程反复致脾气耗损；或由于饮食不节、劳倦太过，或外感湿热等，损伤脾胃，脾失健运，湿雍木郁，累及于肝胆，导致肝失疏泄[13]。故立疏肝理气、健脾化湿之治法。

柴芍六君汤方中柴胡苦平，入肝胆经，透泄少阳之邪，并能疏泄气机之郁滞，使少阳半表之邪得以疏散；重用白芍养血柔肝、缓急止痛；党参甘温益气，健脾养胃；白术苦温，健脾燥湿，加强益气助运之力；佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，与茯神、白术相配，使健脾之功益著；本方以茯神易茯苓，乃因慢乙肝患者多见肝郁，思虑过多，夜寐欠佳，影响肝功能恢复，茯神在《药物化义》中入心、脾二经，在《要药分剂》中入心经兼入肝经，有宁心、安神之效，能改善睡眠，促进肝功能恢复；半夏辛温而燥，化湿祛痰，降逆和胃止呕；陈皮调理气机以除胸脘痞闷，止呕以降胃气，燥湿化痰以消湿聚之痰，使气顺而痰消；柴胡疏肝解郁，使肝气条达；炙甘草益气和中，调和诸药；四药配伍，共奏疏肝理气、健脾化湿之功。

本研究结果显示，治疗24周后，观察组患者肝郁脾虚证症状(胁肋胀痛、腹胀、便溏、纳呆食少、身倦乏力)评分显著低于对照在，提示加用柴芍六君汤有助于改善慢性乙型肝炎肝郁脾虚证患者的中医证候，观察组患者的肝功能指标AST、ALT、TBIL、GGT和肝纤维化指标HA、PCⅢ、Ⅳ-C、LN明显低于对照组，说明加用柴芍六君汤可进一步改善慢性乙型肝炎肝郁脾虚证患者的肝功能，发挥更好抗纤维化作用；治疗24周后疗效统计学发现，观察组总有效率(90.57%)以及HBsAg、HBeAg、HBV-DNA转阴率明显高于对照组，提示加用柴芍六君汤治疗慢性乙型肝炎肝郁脾虚证患者肝纤维化的疗效更佳。Treg与Th17细胞均为CD4+效应T细胞亚型，Treg抑制特异性免疫反应，有利于慢性乙型肝炎疾病的进展；Th17细胞具有促炎症反应的作用，通过促进炎性细胞浸润及组织损伤，加重肝细胞损伤；二者之间的平衡是慢性炎症持续发展的重要因素之一[14,15]。慢性乙型肝炎患者的Treg、Th17细胞水平都明显增加，以Th17细胞升高为主，Treg/Th17比率变化可提示患者体内免疫功能增减，慢性乙型肝炎患者的Treg/Th17比率处于免疫失衡状态，Treg /Th17比率是临床判定慢性乙型肝炎患者病情轻重、疗效、预后的有效指标[16-17]。现代药理学研究证实[18-20]，人参主要组方人参皂苷Rb1可改善自发性高血压下的Th17 /Treg 细胞平衡，半夏提取物通过改善Treg/Th17比例发挥增强免疫的作用，白芍总苷通过调节Th17/Treg平衡及其相关细胞因子发挥抑炎效果。本研究结果显示：治疗24周后，观察组患者外周血Treg/Th17比率明显少于对照组，说明柴芍六君汤可能通过调节Treg/Th17比率，改善慢性乙型肝炎患者的免疫网络平衡，从而发挥治疗作用。

综上所述，在常规治疗基础上，柴芍六君汤治疗慢性乙型肝炎肝郁脾虚证可促进患者中医证候、肝功能和肝纤维化的改善，提高临床疗效和抗病毒效果，调节Treg/Th17比率可能是其作用途径之一，值得临床借鉴使用。