黄连解毒汤调控apoE-/-小鼠粒细胞释放中性粒细胞捕捉网的研究*

孙慧娟，朱镠娈，张 玥，陈 冰，薛 欣，曾 辉，马雅銮△

(1. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700； 2. 首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所，北京 100015； 3. 新发突发传染病研究北京市重点实验室，北京 100015)

高脂血症(hyperlipidemia, HP)可引起机体慢性炎症[1]，导致动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发生发展。在这一过程中，单核细胞与其分化生成的巨噬细胞发挥了重要作用[2]。前期研究发现，黄连解毒汤干预可以降低高脂导致的炎症型单核细胞，减轻全身和血管局部炎症反应，最终抑制高脂饮食喂饲的apoE-/-小鼠AS斑块形成[3-4]。

在高脂血症引发AS发生发展的过程中，除单核细胞和巨噬细胞之外，其他免疫细胞也参与AS相关的炎症反应[5]。粒细胞是成人外周血比例最高的白细胞，也是天然免疫系统的第一道防线。但由于中性粒细胞主要功能是清除病原体和坏死组织，此类细胞在AS这种无菌性疾病中的作用并未引起足够重视。近期研究发现，中性粒细胞活化后，其胞内DNA、组蛋白和多种酶形成复合物，被主动释放到胞外，形成中性粒细胞胞外捕捉网(neutrophil extracellular traps, NETs)[6]。NETs可以能够捕获和杀灭病原体，同时也可以引起组织炎症损伤[6]。研究发现，NETs含量与AS严重程度相关[7]。

本研究关注apoE-/-小鼠外周血中粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞/淋巴细胞(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)变化以及粒细胞释放NETs水平，探讨黄连解毒汤能否改善高脂所致的NLR和NETs变化，减轻高脂造成的粒细胞活化，进一步揭示黄连解毒汤对高脂血症/AS的免疫调节机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性8周龄C57BL/6及apoE-/-小鼠，体质量(20±2)g，所有实验用鼠均购于北京大学实验动物中心(动物许可证号SCXK(京)2016-0010)，实验干预小鼠饲养于北京大学实验动物中心，SPF条件。

1.2 药物

黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按3∶2∶2∶3比例组成，饮片购于北京同仁堂药店，药材均经鉴定，按常规方法煎煮取汁，浓缩成相当于黄连解毒汤生药0.5 g/mL。阿托伐他汀20 mg/片(批号S36972)，美国辉瑞制药有限公司生产。

1.3 试剂及仪器

TC、TG、LDL-C和HDL-C试剂盒，日本和光公司；Quan-iT PicoGreenTMdsDNA 检测试剂盒，美国Thermo公司；FACS Callibur流式细胞仪，美国BD公司；自动酶联免疫系统，美国Thermo公司；Beckman CX4全自动生化分析仪，美国贝克曼·库尔特公司。

1.4 动物分组及干预方法

实验动物分5组，每组10只小鼠。C57BL/6+普食为对照组(C57BL/6+CD)；apoE-/-小鼠采用配对比较法随机分为apoE-/-+普食组(apoE-/-+CD)、apoE-/-+高脂组(apoE-/-+WD)、apoE-/-+高脂+黄连解毒汤组(apoE-/-+WD+HLJDT)、apoE-/-+高脂+阿托伐他汀组(apoE-/-+WD+Atr)。高脂饲料含78.85%基础饲料，0.15%胆固醇，21%脂肪。干预组小鼠根据体质量每天给予临床等效剂量(阿托伐他汀[3 mg/(kg·d)]、黄连解毒汤[5 g/(kg·d)])，其他小组采用等量纯净水灌胃。每周检测体质量变化，分别干预4周和18周。

1.5 检测指标及方法

干预4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠异戊烷吸入麻醉，小鼠摘眼球采EDTA抗凝血，离心(800×g, 10 min)后取血浆，用于血脂和NETs检测；血细胞用于流式细胞仪检测。干预18周的C57BL/6及apoE-/-小鼠剥离胸腹主动脉，用于病理检测。

1.5.1 血脂水平测定 干预4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠血浆采用过氧化酶法测定血浆胆固醇(cholesterol，TC)；脂肪酶/甘油磷酸酯氧化酶-过氧物酶比色法测定甘油三酯(triglyceride，TG)；直接法测定低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)。

1.5.2 外周血粒细胞及淋巴细胞比例检测 干预4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠的血细胞加入获取血浆等量PBS，裂解红细胞后应用FACS Callibur流式细胞仪(美国BD公司)检测。根据前向散射角和侧向散射角分出粒细胞和淋巴细胞。

1.5.3 NETs cfDNA检测 干预4周的C57BL/6及apoE-/-小鼠血浆采用PicoGreen 法定量检测血浆中NETs cfDNA的含量。

1.5.4 病理染色 干预18周的C57BL/6及apoE-/-小鼠，剥离胸腹主动脉，用4%多聚甲醛固定， 20%蔗糖脱水，经油红O染色、分化后观察。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 血脂水平比较

表1显示，黄连解毒汤和阿托伐他汀干预后对高脂喂饲的apoE-/-模型小鼠血脂影响。与既往研究一致，黄连解毒汤干预后TC、TG、HDL和LDL的水平均未见显著改变(P>0.05)。

表1 各组动物血脂水平比较

注：与野生普食组比较：**P<0.001； 与apoE-/-高脂组比较：#P<0.05，##P<0.001

2.2 外周血粒细胞、淋巴细胞比例及NLR的变化

表2显示，与野生小鼠比较，普通饮食喂饲的apoE-/-小鼠外周血粒细胞比例显著升高，淋巴细胞比例降低，NLR升高(P<0.05)。4周高脂饮食后，apoE-/-模型小鼠外周血粒细胞比例进一步升高，淋巴细胞比例进一步降低，NLR显著升高(P<0.05)。黄连解毒汤和阿托伐他汀干预apoE-/-小鼠粒细胞降低，淋巴细胞比例升高，差异无统计学意义(P>0.05)，但NLR明显降低(P<0.05)。

表2 各组动物外周血粒细胞、淋巴细胞比例及

注：与野生普食组比较：*P<0.05，**P<0.001；与apoE-/-高脂组比较：#P<0.05，##P<0.001

2.3 血浆NETs cf DNA含量比较

表3显示，NETs DNA可在血液中成为细胞游离DNA(cell free DNA，cfDNA)[8]。结果发现，与正常对照小鼠和普食apoE-/-小鼠比较，高脂饮食的apoE-/-小鼠血浆cfDNA水平显著增高(P<0.001)。经4周干预，黄连解毒汤显著下调cfDNA水平(P<0.05)，阿托伐他汀无明显影响cfDNA水平(P>0.05)。

表3 各组动物血浆cfDNA 水平比较

注：与野生普食组比较：*P<0.05，**P<0.001；与apoE-/-高脂组比较：#P<0.05，##P<0.001

2.4 动物主动脉斑块形成情况

图1显示，饲养18周的apoE-/-普食组主动脉弓和主动脉干可见不规则零散粥样硬化斑块，高脂喂饲apoE-/-主动脉干斑块数量增多，面积增大，主动脉弓可见大片斑块；黄连解毒汤和阿托伐他汀干预后，主动脉血管斑块面积显著减小。

图1 油红O染色检测主动脉病理组织变化

3 讨论

长期高血脂引发机体免疫异常、系统性炎症反应，包括多种免疫细胞的数量和功能失常，炎症介质过量产生，导致脂质清除障碍，促进AS形成发展[2,5]。单核/巨噬细胞既是天然免疫细胞，又是血管AS斑块主要的组成细胞，在AS中起重要作用，受到极大关注[2]。黄连解毒汤出自《肘后备急方》，是清热解毒的经典代表方。近年越来越多临床与研究证明，黄连解毒汤对于高血脂导致的AS有治疗作用[3-4,9]。

中性粒细胞因其寿命短暂、更新迅速、表型不稳定、无特异性标记等，在AS病变过程中的作用一直未引起重视[10]。随着近年来粒细胞表型精准确定，粒细胞在AS中的作用逐渐受到重视。高脂血症及冠心病患者中性粒细胞数量增多[11]，活化的中性粒细胞释放NETs含量与冠心病的严重程度相关[7]。中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)升高会增加AS的患病率[12]。研究发现，中性粒细胞通过多种机制参与AS的病变[13-14]。首先，粒细胞是黏附于血管内皮的首发和主要白细胞，通过呼吸爆发产生细胞毒性和氧化活性，引发氧化应激和组织进行性损伤，导致内皮功能障碍和血管炎症，直接影响血管AS形成[15]。其次，NETs激活pDCs分泌IFN-a，扩大炎症促进AS斑块面积增大，增加斑块破裂的风险[16]。第三，粒细胞不仅引发炎症反应，还通过分泌炎性细胞因子募集活化单核细胞等其他免疫细胞，放大炎症反应，参与AS斑块的形成[17]。

本研究发现，与野生小鼠比较，apoE-/-小鼠外周血中粒细胞数目上升虽然没有显著差异，但NLR已经显著升高，提示造血系统向生成粒细胞倾斜。同时，尽管难以直接检测AS中的NETs，但考虑到高脂血症可以引发系统性炎症，因此检测NETs释放至血液中的cfDNA，发现高脂饮食apoE-/-小鼠血浆cf DNA显著增多，提示高脂导致NETs的大量生成[16]。前期研究已经发现，黄连解毒汤干预降低高脂引发apoE-/-小鼠外周血单核细胞及其炎症亚型比例[3-4]。本研究中，黄连解毒汤虽然没有显著降低高脂引发的粒细胞比例，但显著降低NLR，减少血浆cfDNA 即NETs含量。因此，黄连解毒汤还可能通过调节控制粒细胞功能，纠正NETs和NLR，抑制和延缓AS形成。在研究干预4周和18周内，未检测到血脂水平明显改善，可见黄连解毒汤的免疫调节作用不依赖于其降脂作用。

综上所述，本研究发现黄连解毒汤干预可以通过调控粒细胞免疫，抑制炎症反应，降低高脂引发的免疫损伤，抑制AS斑块形成。

由于粒细胞是AS炎症反应的始发细胞，且人体粒细胞占循环白细胞比例与小鼠粒细胞比例有很大差异，我们检测到小鼠粒细胞只占循环白细胞10%～15%，而人体循环中粒细胞比例高达50%～70%[14]。由此推测，粒细胞的异常在人体免疫及AS中的作用应该更为显著。因此本研究认为，调控失常的粒细胞，对预防和治疗AS有很好的前景。