黄颡鱼体表溃烂症初步研究

杨移斌，姜 兰，宋 怿，董 靖1,，胥 宁1,，艾晓辉1,

(1.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉 430223；2.农业部渔用药物创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，中国水产科学研究院珠江水产研究所，广州 510380；3.农业部水产品质量安全控制重点实验室，北京 100141)

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)是我国重要的特种水产养殖品种之一，因其肉质鲜美，营养丰富，深受广大消费者喜爱。在经济利益的推动下，我国水产科技工作者突破了黄颡鱼人工繁育，甚至培育出全雄黄颡鱼，给养殖户提供了充足的苗种需求，使得养殖规模及区域不断扩大，养殖产量不断攀升，满足了市场的需求。在如此形势下，养殖黄颡鱼也遇到不少困难，其中之一就是病害问题，直接导致黄颡鱼养殖失败案例比比皆是。目前黄颡鱼病害主要分为两大类，一类是生物病原性疾病，主要包括细菌性疾病[1]、真菌性疾病[2]、寄生虫寄生疾病[3]及病毒病[4]等；二类是非生物引起的疾病，主要包括环境、营养不适以及人工操作不当等导致的疾病[5]。病害问题成为了养殖黄颡鱼需要急切突破的技术瓶颈。

2018年9-10月，浙江湖州某养殖场黄颡鱼出现体表溃烂症，发病率很高，而且造成养殖黄颡卖相不好，价格低，给养殖户造成了重大经济损失。本研究就该病进行流行病学调查，病因确定及防治药物进行初步筛选，以期为黄颡鱼体表溃烂病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鱼

体表具有典型溃烂症的黄颡鱼采自浙江湖州某黄颡鱼养殖场；感染用黄颡鱼(30±2)g购于武汉江夏某养殖场，所购黄颡鱼体表无明显伤痕，体格健壮游泳能力强，在玻璃缸内暂养7 d后开展试验。

1.1.2 试验试剂

试剂：TCBS琼脂、营养肉汤、营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、MH琼脂、药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒购自solarbio公司；2×Taq PCR Mix、引物合成、胶回收试剂盒、PMD-19T载体、琼脂糖H及测序服务均由上海生工提供；尼泊金乙酯、丙酸钙、脱氢乙酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠及硫酸铜(均为化学纯)均为国药集团(上海)化学试剂集团出品。

仪器：PCR仪、恒温干燥箱、高压灭菌锅、离心机、冰箱、无菌操作台以及电泳仪等。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查

对发病黄颡鱼养殖场内外环境进行调查，并检测发病水温、水质及水源是否出现污染等情况，向养殖户询问养殖黄颡鱼发病情况、以往病例以及用药情况。现场对病鱼进行解剖，观察发病黄颡鱼鳃部及主要内脏器官有无寄生虫，是否出现肿大、充血等病变。就本次黄颡鱼发病情况，取具有体表溃烂典型症状的病例进行液氮冻存，带回实验室进行下一步分析。

1.2.2 病原分离

取具有典型溃烂症(如图1所示)的黄颡鱼5尾，在其未溃烂处表面使用75%酒精进行喷洒消毒处理，用无菌刀片刮下溃烂肌肉，无菌去掉污物后，取5小块(0.8 cm×0.3 cm×0.2 cm)溃烂肌肉置于5个PDA平板上，同时使用经酒精灯灼烧后的接种环蘸取溃烂组织，划线于TCBS及普通营养琼脂平板上，将PDA平板置于25 ℃恒温培养箱中培养24～36 h，将TCBS及普通营养琼脂平板放置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h。PDA板上的菌株进行接种纯化，最终长出单一的霉菌，接种于斜面培养基上进行干燥冷冻保存，暂命名HSZJ01。同时挑取TCBS及普通营养琼脂平板上形状、大小及颜色基本一致的菌落进一步纯化，获得分离菌株的纯培养物，加入15%的甘油混匀后置于-80 ℃保存，分别暂命名为HSZJ02、HSZJ03。

图1 发病黄颡鱼症状Fig.1 Symptoms of P.fulvidraco

1.2.3 人工感染

1.2.3.1 分离株HSZJ01对黄颡鱼的致病性研究

将分离株HSZJ01接种于PDA平板上，25 ℃培养48 h，使得菌丝长的铺满平板，置于4 ℃备用。

将60尾黄颡鱼分到两个玻璃缸进行养殖，即A组和B组，每组共30尾，每尾黄颡鱼均在体表轻微割伤，以不出血为准。参照孙琪等水霉浸泡感染方法[6]，取数个长满菌丝的平板去掉培养皿后，将带培养基的菌丝放入滤网中，置于A组养殖水体，使水体孢子浓度达到104个/mL，而B组正常养殖，不加入菌丝。养殖条件：连续充氧，水温(25±2)℃，pH 6.8～7.5，其他水质指标符合渔业生产标准。定时观察A、B组的黄颡鱼活动情况，体表是否出现异常等，及时记录，并对可能濒死的黄颡鱼进行解剖观察。

1.2.3.2 分离株HSZJ02、HSZJ03对黄颡鱼的致病性研究

将分离株HSZJ02、HSZJ03菌株接种于普通营养琼脂培养基上，同置于28 ℃恒温培养24 h。

将感染用黄颡鱼分为4组，每组30尾，分别为C、D、E、F组，其中C、E组养殖用水中分别加入分离菌株HSZJ02、HSZJ03，使其浓度分别达到104、105CFU/mL，而对照D、F组正常养殖，每尾黄颡鱼均在体表轻微割伤，以不出血为准。养殖条件与1.2.3.1相同。定期观察黄颡鱼游泳状况，对发病死亡鱼进行解剖观察，并进行细菌再分离。

1.2.4 分离株HSZJ01分子鉴定

参照动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒说明进行HSZJ01总DNA提取，提出的总DNA即作为PCR模板。引物ITS1: 5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′和ITS4:5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC3′[7]。PCR反应体系：2×Taq PCR Mix 50 μL、ddH2O 47 μL、引物各1 μL及模板1 μL ；反应条件：95℃，3min；95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；35个循环； 72℃延伸10min，4℃。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶验证为目的片段后进行切胶，并进行胶回收。将胶回收产物连接到pMD-19T 载体上，再转化大肠杆菌感受态内，涂板后挑出单克隆并进行阳性验证，将阳性克隆送上海生工测序。

1.2.5 药物筛选

1.2.5.1 抗生素筛选

药敏实验采用纸片琼脂扩散法，参照NCCLS抗微生物药物敏感性实验执行标准进行[8]。将分离菌株HSZJ01接种于液体PDA培养基中，使得孢子浓度达到102个/mL，再取200 μL均匀涂布于PDA平板上，后贴上不同的药敏纸片25 ℃培养36 h后测量药物抑菌圈直径，结果用平均直径±SD表示。

1.2.5.2 消毒剂筛选

将尼泊金乙酯、丙酸钙、脱氢乙酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠及硫酸铜等化学药物均配制成100 mg/mL的溶液，裁剪8 mm圆形纸片浸泡于各溶液中24 h，即制成药敏纸片，置于4 ℃备用。将分离菌株HSZJ01接种于液体PDA培养基中，使得孢子浓度达到102个/mL，再取200 μL均匀涂布于PDA平板上，后贴上不同的药敏纸片25 ℃培养36 h后测量药物抑菌圈直径，结果同样用平均直径±SD表示。

2 结果

2.1 流行病学调查结果

本次发病的养殖场位于浙江湖州，湖州是国内黄颡鱼主要集中养殖地，规模达数千公顷。此次发病水面约0.7 hm2，属黄颡鱼精养池塘，周边池塘养殖的也多是黄颡鱼，发病率约60%，死亡率近40%，发病规格多为100～200 g的商品鱼，并且因溃烂症在鱼体表，影响美观，影响销售，给养殖户造成巨大经济损失。经临床诊断发现发病鱼体表溃烂明显，甚至烂穿漏出内脏，鳃部有充血迹象，肝脏脂化严重，肝肾脾无充血，无肿大，亦未发现寄生虫，但取溃烂肌肉组织进行镜检发现有菌丝存在。现场水质检测结果为水温24 ℃，pH 8.5，氨氮0.3 mg/L，亚硝酸盐0.05 mg/L。据调查，黄颡鱼暴发此类疾病在一年的养殖周期主要有两个时间段，一是5月中旬-6月底，二是9月中下旬-10月下旬，水温多在18～25 ℃，而水温达到30 ℃以上则基本不发病。养殖在预防治疗此类疾病时，多采取调节水质，外用碘制剂消毒，内服氟苯尼考或者恩诺沙星等药物的方案，效果往往不是很理想，但当消毒剂中添加硫酸铜，效果较好。

2.2 分离菌株人工感染及分子鉴定

经人工感染试验，发现使用3株分离菌株浸泡割伤的黄颡鱼，仅HSZJ01浸泡实验组黄颡鱼出现体表严重溃烂，发病率为66.67%，与自然发病症状类似，镜检可以在其溃烂肌肉中明显发现菌丝，并从感染发病黄颡鱼体内再次分离到菌株HSZJ01，表明分离株HSZJ01是黄颡鱼此次发病的病原。

将分离菌株HSZJ01的ITS序列放入NCBI中进行blast比对，结果显示HSZJ01与不规则毛霉(Mucorirregularis)同源性最高，通过构建系统发育树分析(图2)，其结果显示HSZJ01与不规则毛霉聚为一支。因此判定HSZJ01为不规则毛霉。

2.3 药物筛选

本次选取了5种抗生素以及6种消毒剂作为试验药物，结果显示抗生素中两性霉素对HSZJ01抑菌效果最好，而消毒剂中硫酸铜抑菌效果最佳，具体见表1。

3 讨论

随着水产养殖的发展，水产动物病害日益增多，而养殖动物体表溃烂症在养殖过程中广泛流行。目前已经报道的患过此类疾病的养殖品种有鳗鲡(Anguillajaponica)[9]、黄鳝(Monopterusalbus)[10]、黄颡鱼Pelteobagrusfulvidraco[11]、罗非鱼(Oreochromisniloticus)[12]、石斑鱼(Epinephelussp)[13]、鮸鱼(Miichthysmiiuy)[14]、泰山螭霖鱼(Varicorhinusmacrolepis)[15]、诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobiuschulae)[16]、中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)[17]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[18]等，主要症状以体表溃烂为主，溃烂部位不定，主要是肌肉溃烂，发病个体无规格差异，无地区差异，但因养殖品种、养殖环境以及地理因素等，导致发病的病原多种多样，有真菌[9]、细菌[11]以及浮游生物[19]等等。因水产养殖动物体表溃烂症病情复杂多变，给防控带来了极大的麻烦，并且影响鱼体美观，销售价格低下，因此给养殖户带来极大经济损失，是水产养殖业的一重要瓶颈。

图2 HSZJ01株 ITS基因序列与相关菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS gene sequence of HSZJ01 strain and its relatives

表1 菌株HSZJ01药物筛选结果Tab.1 Antibiotic screening results

同样随着黄颡鱼养殖业的迅猛发展，养殖过程中同样病害频发，使得黄颡鱼养殖产业举步维艰。近年来溃烂症也时常在黄颡鱼养殖过程中大规模爆发，主要症状仍然是体表溃烂，甚至烂穿漏出内脏，并造成死亡，逐渐成为黄颡鱼养殖的一大危害。目前关于黄颡鱼体表溃烂症的报道也很多，但主要病原集中报道为温和气单胞菌[20]、拟态弧菌[21]以及维氏气单胞菌[11]等，相关研究对黄颡鱼体表溃烂症的防控提供一定的参考意义。

本次浙江湖州出现黄颡鱼体表溃烂症，危害较大，主要症状与以往黄颡鱼体表溃烂症症状类似，但经临床诊断及病原分离共纯化获得3株分离株，分别暂命名为HSZJ01、HSZJ02及HSZJ03。经浸泡人工感染试验发现只有HSZJ01能够使受伤黄颡鱼出现溃烂症，并可以从感染发病的黄颡鱼溃烂体表再次分离到HSZJ01，表明HSZJ01为此次黄颡鱼发病的病原。分子鉴定发现HSZJ01为不规则毛霉，是一种真菌，而黄颡鱼暴发该病的温度介于18～25 ℃之间，符合真菌发病条件，也佐证了分离株HSZJ01是黄颡鱼此次体表溃烂症的病原。 此次发现真菌导致黄颡鱼发病的研究结果与鳗鲡腐皮病真菌病[9]存在一定的相似性。另本次黄颡鱼发病与世界动物卫生组织(OIE)《水生动物卫生法典》所列的疫病流行性溃疡综合征[22]症状存在类似，但据病原学研究发现，本次黄颡鱼发病是由不规则毛霉引起，而非丝囊霉菌，其进一步危害值得关注。

不规则毛霉分离于一例原发性皮肤病患者。最初被命名为多变根毛霉，但随着近年来分子生物鉴定技术的迅猛发展，发现多变根毛霉在种系发生关系上与毛霉属，尤其冻土毛霉具有最近的亲缘关系，因此，2011年多变根毛霉被更名为不规则毛霉[23]。不规则毛霉主要引起人类继发性皮肤感染病例，中国、澳洲、日本、美国及印度等均有病例报告。据文献资料显示，不规则毛霉为一种室外真菌，在全球都有分布，并且在土壤、动植物以及昆虫肠道中广泛存在[23]。此次发现黄颡鱼感染不规则毛霉发病，在国内尚属首次。

在水产养殖动物病害治疗过程中，药物仍然是重要的手段。本研究通过纸片扩展法，研究了5种抗生素以及6种消毒剂对分离菌株HSZJ01的抑菌效果，结果显示抗生素中两性霉素对HSZJ01抑菌效果最好，而消毒剂中硫酸铜抑菌效果最佳，因目前尚无水产动物源不规则毛霉的药物敏感资料，因此只有参考人医方面的数据，资料显示不规则毛霉对两性霉素敏感[23]，与本次实验结果一致。此次药物筛选可以为临床防控提供一个参考，但在实际情况下，由于发病鱼多食欲下降，口服疗效差，采用消毒手段效果更佳。