蜡样芽胞杆菌在不同标本中的毒力基因分布特征

张慧娟，张恩民，贺金荣，李 伟，魏建春

蜡样芽胞杆菌(简称蜡样杆菌)在自然界广泛分布，常存在于土壤、灰尘和昆虫中，植物和许多生熟食品中也常见，临床上该菌被认为是一种机会致病菌常引起食源性疾病，也被认为是一种污染菌引发外伤性眼内炎、骨科创面感染以及在肿瘤等免疫低下人群中引起院内感染等肠道外感染疾病[1]。

研究表明，无论是肠道内还是肠道外感染，发病均与该菌分泌的毒素导致组织破坏或胞外酶活性产物有关，编码这些毒素的毒力基因主要包括溶血性BL基因(hblC、hblD、hblA、hblB)、非溶血性基因(nheA、nheB、nheC)、肠毒素FM基因和T基因(entFM、bceT)、细胞毒素K基因(cytK)和呕吐毒素相关基因(ces)[2]。但并不是所有蜡样杆菌都含有全部毒力基因，而是存在菌株间的差异，不同的毒力基因分布与疾病的严重程度呈相关性[3]。我国部分地区已在食品的常规监测中开展了蜡样杆菌的污染与毒力基因的检测工作，本研究中采集了我国12个省的不同分离来源的标本进行了毒力基因的检测，以期深入了解临床相关蜡样杆菌的遗传分布特征，为相关疾病的诊断处置提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株 菌株包括分离自中国河北、海南、云南、内蒙、四川、陕西、福建等12个省的蜡样杆菌330株和购买的模式菌株3株(ATCC10876、ATCC13061和CMCC63301)，分离来源分为环境监测标本(常规食品微生物监测及土壤)和疾病相关标本(食物中毒食品及肠道外感染)2大类，具体包括米粉(96株)、奶粉(125株)、土壤(92株)、米饭(8株)、凉皮(5株)、眼内炎(2株)或肿瘤患者(2株)等6种标本，所有菌株均由本室保存。

1.2 毒力基因检测

1.2.1合成引物 针对上述的11个蜡样杆菌可能含有的毒力基因，参考文献检索引物序列[4-5]，每对引物经NCBI Blast比对验证，确为相应毒力基因片段，引物合成由北京天一辉远生物科技有限公司完成，引物序列及扩增片段长度见表1。

1.2.2PCR扩增 常规煮沸法制备菌株DNA模板，普通酶链聚合反应(PCR)方法扩增所有毒力基因片段，同时设立阳性和阴性对照。PCR反应体系为25 μL，包括2×EasyTaqTMPCR SuperMix(购自北京全式金生物技术有限公司)12.5 μL，上下游引物各1 μL(浓度10 μM)，DNA模板1 μL(浓度为100 ng/μL左右), 加无菌超纯水补足至25 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72℃延伸1 min,共30循环； 72 ℃最后延伸5 min，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 本研究检测毒力基因所用引物
Tab.1 Primers for virulence genes ofB.cereus

基因引物引物序列(5′-3′)长度/bphblAHA-FTTACCTGGTAGAATCGTA-CAAGATC164HA-RCCTGTATTAATCGCTTCTACCAT-TGhblBHB-FAAGCAATGGAATACAATGGG2 685HB-RAATATGTCCCAGTACACCCGhblCHC-FCCTATCAATACTCTCGCAA695HC-RTTTCCTTTGTTATACGCTGChblDHD-FACCGGTAACACTATTCATGC830HD-RGAGTCCATATGCTTAGATGCnheANA-FGTTAGGATCACAATCACCGC756NA-RACGAATGTAATTTGAGTCGCnheBNB-FGTGCAGCAGCTGTAGGCGGT328NB-RATGTTTTTCCAGCTATCTTTCG-CAATnheCNC-FTGGATTCCAAGATGTAATG684NC-RATTACGACTTCTGCTTGTGCcesNrps-FGACAAGAGAAATTTCTACGAG-CAAGTACAAT635Nrps-RGCAGCCTTCCAATTACTCCTTCT-GCCACAGTbceTBceT-FGACTACATTCACGATTACG-CAGAA304BceT-RCTATGCTGACGAGCTACATCCATAentFMentFM-FGTTCGTTCAGGTGCTGGTAC486entFM-RAGCTGGGCCTGTACGTACTTcytKcytK-FCGACGTCACAAGTTGTAACA565cytK-RCGTGTGTAAATACCCAGTT

1.3结果分析 采用SPSS21.0软件，检验水准为α=0.05统计菌株检测阳性毒力基因的数量，单因素方差分析不同标本毒力基因数的差异；计算菌株不同毒力基因的携带率，行×列资料卡方检验分析不同标本毒力基因携带率的统计学差异。

2 结 果

2.1菌株毒力基因携带情况 333株蜡样杆菌11种毒力基因的检测结果显示，菌株所含毒力基因数量最少0个(30株，占9.01%)，最多10个(41株，占12.31%)，含4个毒力基因的菌株数量最多，占19.22%，其次是5个(16.82%)和9个(16.22%)，菌株平均携带毒力基因数5.97个。90.99%(303/333)的菌株检出至少含有1个毒力基因，毒力基因在3个以上的菌株占到88.29%(225/333)，含有5个毒力基因以上的菌株占67.57%(294/333)，除呕吐毒素基因外，全部10个毒力基因均检出的菌株占12.31%(41/333)(图1)。

图1 菌株携带毒力基因个数Fig.1 Distribution of gene numbers of studied strains

2.2不同类型标本毒力基因数量比较 常规食品监测的米粉和奶粉中毒力基因个数分别为5.78和5.71个，而在病例相关采集标本的米饭、凉皮和患者中基因个数分别达到了7.13，8.2和8.75个，均高于平均值，方差分析显示，6种样品的毒力基因携带数量之间无统计学显著差异(F=1.917，P>0.05)，但两两比较显示，患者与奶粉的基因个数统计学差异有显著性(F=5.482，P<0.05)，凉皮与奶粉间有统计学差异显著性(F=4.479，P<0.05)，其他类型样品两两间无统计学差异(表2)。

2.3不同类型标本毒力基因携带率比较 毒力基因中非溶血性基因携带率最高，同时含有3种非溶血性基因(nheA、nheB、nheC)的菌株占61.86%，至少含有一种此基因的菌株则达89.19%；其余基因携带率从高到低依次为entFM基因(79.88%)、bceT基因(49.85%)、溶血性BL基因(48.35%)、ctyK基因(47.75%)和ces基因(1.50%)。其中，溶血性基因中hblB携带率较低(38.14%)，其他3种(hblA、hblC和hblD)携带率较高。

表2 不同样本类型蜡样杆菌毒力基因携带情况
Tab.2 Distribution of virulence gene numbers ofB.cereusin different specimens

样品类型样品数毒力基因平均数米粉965.78奶粉1255.71土壤926.22米饭87.13凉皮58.2患者48.75合计3305.97

不同类型标本毒力基因的携带率之间有差异，将样本数较低(凉皮、眼内炎和肿瘤患者)的标本除外，其余标本的各基因携带率比较显示，米饭、米粉、奶粉和土壤的溶血性基因携带率有统计学差异显著性(χ2=15.071，P<0.01)，米粉和奶粉的携带率较低，土壤携带较高；而非溶血性基因则在土壤中携带较低，其它标本中较高(χ2=9.603，P<0.05)；entFM基因也在土壤中较低，其它标本中较高(χ2=21.634，P<0.01)；cytK、bceT和ces基因在不同标本中的携带率均无统计学差异显著性(表3)。

将样本数较少的标本合并，比较疾病相关与环境监测两类标本的毒力基因携带情况，表4显示溶血性基因在疾病标本中携带较高，有统计学差异(χ2=8.23，P<0.01)，其余基因在两类标本中的携带率无统计学差异。

3 讨 论

蜡样杆菌作为一种重要的食源性疾病病原菌，在食品中的污染状况和毒力基因分布近年来被广泛关注。研究数据显示，食品中的蜡样检出率多在10%以上，婴幼儿食品和奶粉中在10%～30%，熟制米面制品中在20%～30%左右，在快餐盒饭、铁路食品及市场摊点中污染更重，有的可达50%[6-10]，腐乳类食品和大米中的蜡样检出率可高达80%[11-12]。同时，医院内感染中，在开放性创伤的患者伴免疫力低下人群中蜡样杆菌的分离率较高，眼内炎也较多见，外伤所致的细菌性眼内炎中蜡样芽胞杆菌感染率仅次于金黄色葡萄球菌，位居第2，并且进展迅速，急骤恶化，可造成视网膜毁灭性损害[13]，是医院感染中不可忽视的一种重要病原菌。

表3 各毒力基因在不同类型标本中的分布
Tab.3 Distribution of virulence genes ofB.cereusin different specimens

基因总携带率(n=333)不同类型标本的基因携带率(%)凉皮(n=5)米饭(n=8)米粉(n=96)奶粉(n=125)土壤(n=92)眼内炎(n=2)肿瘤患者(n=2)其他(n=3)hblC48.35(161)80(4)62.5(5)38.54(37)38.4(48)67.39(62)100(2)100(2)33.33(1)hblD46.85(156)80(4)75(6)38.54(37)38.4(48)60.87(56)100(2)100(2)33.33(1)hblA45.65(152)80(4)62.5(5)38.54(37)36(45)60.87(56)100(2)100(2)33.33(1)hblB38.14(127)80(4)37.5(3)32.29(31)31.2(39)50(46)100(2)50(1)33.33(1)同时含4个hbl37.24(124)80(4)37.5(3)32.29(31)29.6(37)48.91(45)100(2)50(1)33.33(1)含任一hbl48.35(161)80(4)75(6)38.54(37)36.8(46)68.48(63)100(2)100(2)33.33(1)nheA84.38(281)100(5)100(8)83.33(80)87.2(109)80.43(74)50(1)100(2)66.67(2)nheB72.37(241)80(4)87.5(7)78.13(75)81.6(102)52.17(48)100(2)100(2)33.33(1)nheC82.28(274)100(5)100(8)86.46(83)86.4(108)69.57(64)100(2)100(2)66.67(2)同时含3个nhe61.86(206)80(4)87.5(7)67.71(65)68(85)44.57(41)50(1)100(2)33.33(1)含任一nhe89.19(297)100(5)100(8)90.62(87)93.6(117)80.43(74)100(2)100(2)66.67(2)ctyK47.75(159)60(3)50(4)48.96(47)36.8(46)60.87(56)50(1)50(1)33.33(1)ces1.50(5)00(0)1.04(1)3.2(4)0(0)0(0)0(0)0.00 entFM79.88(266)100(5)87.5(7)87.5(84)87.2(109)59.78(55)100(2)100(2)66.67(2)bceT49.85(166)60(3)50(4)44.79(43)44.8(56)59.78(55)50(1)100(2)66.67(2)

注：n表示样本总数，括号内数字表示相应基因扩增阳性数。

表4 疾病相关标本与环境监测标本中毒力基因携带差异
Tab.4 Different carrying rate between clinical and enviromental monitoring specimens

基因类型疾病相关标本环境监测标本阳性数阳性率(%)阳性数阳性率(%)χ2值P值hbl1482.3514646.658.230.00nhe1710027888.821.110.14ctyK952.9414947.60.180.18ces0051.60.240.77entFM1694.1224879.231.400.09bceT1058.8215449.20.600.15

蜡样杆菌携带的毒力基因与致病性密切相关，食品中蜡样杆菌毒力基因的调查显示非溶血性基因和肠毒素FM基因的携带率均达90%左右，少数报道显示肠毒素FM基因和T基因的携带率较低，约为20%～30%；溶血性基因和细胞毒素K基因的携带率不到50%，尤其是hblC和hblD的携带率有20%[6-7]；呕吐毒素基因的检出率最低，多在5%以下，但大米中含量较高，可达13.8%[12]。

本研究中菌株来源除了常规食品监测样本外，还包含了土壤分离菌株，食物中毒、眼内炎、肿瘤患者等疾病相关标本分离菌株，重点分析了已知的蜡样杆菌11个毒力基因的分布特征，尤其是在疾病相关标本中的特点，可为探索毒力基因的致病性提供参考。研究显示，约90%的蜡样菌株携带至少3个毒力基因，且约10%的菌株携带除呕吐毒素基因外的所有毒力基因，菌株携带的平均毒力基因数目为5.97个，疾病相关标本所携带的毒力基因数目高于环境监测标本。各个基因的分布特点显示，与大多数报道一致[1,6-7]，非溶血性基因和肠毒素FM基因在菌株中的携带率均较高，分别为89.19%和79.88%，溶血性基因和细胞毒素cytK和肠毒素T基因的携带率均在50%左右，呕吐毒素携带率最低1.50%。各毒力基因在米饭、米粉、奶粉和土壤这4类标本中的携带率比较显示，溶血性基因、非溶血性基因和肠毒素FM基因在这些标本中的分布有统计学显著差异，溶血性基因在土壤中的携带率较高，而后两者则较低。其他毒力基因在这些标本中的携带无差异。同时，溶血性基因在疾病相关标本中的携带率相比环境监测标本较高，而其余基因携带率则在两类标本中无统计学差异。由此可见，毒力基因的数目和溶血性基因对蜡样杆菌的致病性具有一定的临床意义。研究表明，溶血素HBL通过溶血亚基L2，溶血亚基L1和结合亚基B蛋白共同作用形成HBL成孔毒素或肠毒素。这3个HBL蛋白分别由hblC，hblD和hblA编码，从一个操纵子共同转录，之后发现了B′蛋白，由hblB编码，该蛋白与B蛋白有73%的同源性，位于起始的158个氨基酸上，且并不是所有含有hbl操纵子的菌株都含有hblB[1]，本研究显示较低的携带率(38.14%)也验证了这一结果。

利益冲突：无