木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物对气管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响▲

窦锡彬 蓝凰齐， 黄小珊 唐汉庆 李克明 王露瑶 林起庆

(1 右江民族医学院基础医学院，广西百色市 533000，电子邮箱：doctordxb@163.com；2 广西中医药大学基础医学院，南宁市 530001)

木姜子为樟科植物山鸡椒的干燥根和根茎，具有较强的抗炎抑菌、提高免疫功能的作用[1]。忍冬藤为忍冬科植物忍冬的干燥茎枝，具有清热解毒、疏风通络之功效，以及较强的抗炎、抗氧化、提高免疫功能的作用[2-3]，同时其对平滑肌有舒张作用[4]因而具有解痉作用。壮族民间用米酒浸泡的木姜子和忍冬藤有温通经络、止咳平喘、补肺益肾、扶正固本的作用，常用于哮喘的治疗。但关于其治疗哮喘的机制，尚未有研究报告。研究表明，气道重塑是哮喘发生的重要机制，涉及气道的结构细胞如气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cell，ASMC)的变化[5]。而ASMC既是气道炎症的靶细胞，也是气道重塑的效应细胞，在气道重塑过程中占有重要地位，ASMC的增殖、凋亡是引发气道结构基础改变及最终气道重塑的潜在变化因素。本实验拟通过观察木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物对ASMC增殖、凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，为其应用提供基础研究的资料。

1 材料与方法

1.1 试验药物 木姜子购自广西仁济堂中药饮片公司(批号：151101)，忍冬藤购自广西张益堂中药饮片有限公司(批号：1602092)。将木姜子和忍冬藤按照质量1 ∶1的比例，放到适量70%食用乙醇里浸泡。1周后，放入回流装置中，加热回流1 h，过滤，滤渣再加入适量的70%乙醇，再次加热回流1 h，过滤后合并两次滤液，用真空旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩，浓缩液放入真空干燥箱70℃干燥，得到乙醇提取物粉末。取乙醇提取物粉末溶于水，分别配制成5.65 μg/mL、11.3 μg/mL、22.6 μg/mL浓度的试验药物。

1.2 细胞株及主要试剂 ASMC由武汉博士德生物医药公司提供。杜氏改良伊格尔培养基/汉氏F-12营养培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium/Ham′s nutrient mixture F12,DMEM/F12)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、胎牛血清购自凯基生物科技公司(批号：11320-033、33210-057、10091-148)；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 购自Biosharp公司(批号：0793)；转化生长因子β1( transforming growth factor β1，TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素(interleukin,IL)-4、IL-13、IL-17酶联免疫吸附测定试剂盒(批号：EMC107b.48、EMC103.48、PL2001420、PL2001425、PL2001432)，以及B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)、β-肌动蛋白鼠源一抗、兔抗鼠二抗由欣博盛生物科技有限公司提供(批号：HCA310A、HCA310P)；脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒由上海翊圣生物科技有限公司提供(批号：40308ES20)。

1.3 主要仪器 MCO-15AC型CO2恒温培养箱(日本SANYO公司)；RE-5210A型旋转蒸发仪(上海亚荣公司)；MK3型酶标仪(美国Thermo Labsystems公司)；DU530型紫外分光光度仪(美国Beckman公司)；PowerPac HC型电泳仪(美国伯乐公司)；IX51型倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养及分组：将ASMC加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，静置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。镜下观察细胞逐渐汇合达80%以上，进行首次传代，加入胰蛋白酶，当出现细胞边缘透亮、胞质回缩现象时，吸弃胰蛋白酶，终止消化。取细胞悬液，加入DMEM/F12培养基按1 ∶2或1 ∶3密度接种传代培养，每3 d换液传代1次。取处于对数生长期、生长状态良好的ASMC，胰酶消化后，用含1%胎牛血清的DMEM/F12培养基将细胞密度调整到5×104个细胞/mL，接种于96孔板(100 μL/孔)，同时设空白孔，37℃培养过夜(在96孔板周围孔内加入100 μL无菌磷酸缓冲盐溶液，培养24 h，使细胞同步)。随后将细胞分为5组，加入相应的药物进行干预：(1)空白对照组(空白组)，加入1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培养基10 μL；(2)PDGF诱导模型组(模型组)，加入20 μg/mL PDGF 10 μL+1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培养基10 μL；(3)低浓度组，加入5.65 μg/mL木姜子及忍冬藤乙醇提取物20 μL+20 μg/mL PDGF 10 μL +1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培养基10 μL；(4)中浓度组，加入11.3 μg/mL木姜子及忍冬藤乙醇提取物20 μL+20 μg/mL PDGF 10 μL+1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培养基10 μL；(5)高浓度组，加入22.6 μg/mL木姜子及忍冬藤乙醇提取物20 μL+20 μg/mL PDGF 10 μL+1%胎牛血清10 μL+DMEM/F12培养基10 μL。

1.4.2 细胞增殖抑制率的检测：各组细胞置于37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中分别培养6 h、12 h、18 h、24 h、36 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h，吸弃培养液，用酶标仪于490 nm波长处测定各孔吸光度值(A值)，以模型组为参照，计算增殖抑制率。每组设置6个复孔，实验重复3次。增殖抑制率=(模型组A值-各组A值)/模型组A值×100%。

1.4.3 细胞凋亡的观察：各组细胞放入37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h，4%多聚甲醛溶液室温固定1 h，磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，5 min/次，滴加TUNEL反应液，按照TUNEL凋亡检测试剂盒的说明步骤进行操作，最后在显微镜下观察、拍片。凋亡细胞核呈蓝色荧光、核固缩。

1.4.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的检测：各组细胞放入37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h后，收集细胞，磷酸缓冲盐溶液清洗2 次，加细胞裂解液，冰浴裂解30 min，4℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液即为蛋白质溶液，二喹啉甲酸法进行蛋白定量后，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转聚偏氟乙烯膜。5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭3 h后，分别加入Bcl-2、Caspase-3、β-肌动蛋白鼠源一抗(1 ∶500),4℃孵育过夜，1×TBST洗3次，加入兔抗鼠二抗(1 ∶2 000)，室温孵育 2 h，1×TBST 洗 3 次，用电化学发光试剂显色并曝光，凝胶系统拍片。将结果图像输入电脑，利用图像分析软件检测条带的灰度值(条带面积×条带密度)。以β-肌动蛋白为内参，以各目的蛋白条带灰度值/β-肌动蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达量。

1.4.5 TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平检测：取各组细胞放入37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养24 h后，吸取上清液，按照酶联免疫吸附试剂盒说明书步骤检测细胞因子TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17的水平。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，重复测量资料采用重复测量方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组ASMC增殖抑制率比较 各组ASMC增殖抑制率差异有统计学意义(F组间=345.214，P组间<0.001)，各浓度组的抑制率均高于模型组(均P<0.05)，且低浓度组、中浓度组、高浓度组的抑制率依次升高(均P<0.05)；抑制率有随时间增加的趋势(F组间=624.541，P组间<0.001)；时间与分组有交互作用(F交互=62.418，P交互<0.001)。见表1。

表1 各组ASMC增殖抑制率比较(x±s)

注：与模型组比较，*P<0.05；与低浓度组比较，#P<0.05；与中浓度组比较，aP<0.05。

2.2 各组细胞凋亡现象 空白组和模型组在观察的视野内没有见到凋亡细胞，低浓度组可以观察到有部分细胞凋亡和核固缩现象，中浓度组和高浓度组可以观察到凋亡细胞增多，核固缩、核碎裂凋亡特征增多。见图1。

空白组 模型组 低浓度组 中浓度组 高浓度组

图1 各组细胞凋亡情况

2.3 各组凋亡蛋白Caspase-3和抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平的比较 与空白组比较，模型组Caspase-3蛋白表达水平降低而Bcl-2蛋白表达水平升高(均P<0.05)；与模型组比较，各浓度组Caspase-3蛋白表达水平均升高而Bcl-2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。见表2和图2。

表2 各组Caspase-3和Bcl-2蛋白相对表达水平比较(x±s)

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

图2 各组Caspase-3和Bcl-2蛋白表达情况

注：A、B、C、D、E分别为空白组、模型组、低浓度组、中浓度组、高浓度组。

2.4 各组细胞因子水平的比较 与空白组比较，模型组TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，各浓度组TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均有不同程度降低(均P<0.05)。见表3。

表3 各组TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平比较(x±s，pg/mL)

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

3讨 论

哮喘是严重威胁人类健康的常见变态反应性疾病，其发病与遗传、环境等因素密切相关[6]。哮喘主要病理特征是气道炎症以及气道重塑[7]。全球哮喘防治倡议将吸入性糖皮质激素作为哮喘治疗的常用药物[8]，其控制气道炎症的效果值得肯定，但对气道重塑、降低气道高反应性的效果仍需要长期观察。因此，对于气道重塑的机制尚需要持续深入的研究。气道重塑是气道壁结构的病理性改变，是引起哮喘反复发作、病程迁延的重要原因，其中ASMC的病理改变是气道壁增厚和结构异常的重要因素[9]，在气道重塑发生机制中具有重要作用。ASMC的病理改变主要表现为过度增殖、凋亡减少、合成分泌功能活跃等。因此，靶向干预ASMC病理改变从而抑制气道重塑成为潜在的治疗哮喘的策略。

研究表明，ASMC过度增殖是引起气管狭窄和气道重塑的主要因素[10]。PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，可刺激ASMC增殖，PDGF诱导的ASMC增殖模型已被广泛用于哮喘气道重塑机制的研究。因此，本研究应用PDGF建立ASMC增殖模型，观察木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物对气道重塑的干预效果及其可能机制。结果显示，各浓度组的细胞增殖抑制率均高于模型组，低浓度组、中浓度组、高浓度组的抑制率依次升高，且抑制率均随时间延长而逐渐升高(均P<0.05)，这提示不同浓度的木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物对ASMC增殖均有抑制作用，且呈一定的浓度及时间依赖性。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2通路是引起ASMC增殖的重要通路，而IL-17通过ERK1/2通路与ASMC上的IL-17受体结合，促进ASMC的增殖。研究表明抑制IL-17、IL-4、IL-13可缓解气道炎症，减轻PDGF诱导的ASMC增殖[11]。ASMC具有很强的合成分泌功能，通过分泌TGF-β1、VEGF并升高IL-17水平而促进ASMC的增殖，而降低TGF-β1和VEGF水平可抑制IL-17水平，从而减轻气道炎症和哮喘发作[12-13]。本研究结果显示，与空白组比较，模型组TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均升高(均P<0.05)；与模型组比较，各浓度组TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17水平均有不同程度降低(均P<0.05)。这提示木姜子和忍冬藤配伍醇提取物可抑制ASMC分泌TGF-β1、VEGF、IL-4、IL-13、IL-17等细胞因子，从而抑制细胞增殖。

ASMC增殖与凋亡紧密相关。ASMC的过度增殖和凋亡减少均可引起气道壁增厚，导致气道重塑。抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Caspase-3是调控ASMC增殖的关键因子[14-15]。本研究中，低浓度组可以观察到有部分细胞凋亡和核固缩现象，中浓度组和高浓度组可以观察到凋亡细胞增多，核固缩、核碎裂等凋亡特征明显，这表明木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物可以诱导ASMC凋亡。此外，与空白组比较，模型组Caspase-3蛋白表达水平降低而Bcl-2蛋白表达水平升高(均P<0.05)；与模型组比较，各浓度组Caspase-3蛋白表达水平均升高而Bcl-2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。因此，推测木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物可能通过促进凋亡蛋白Caspase-3表达并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，从而诱导ASMC 凋亡。

综上所述，木姜子和忍冬藤配伍醇提取物可抑制ASMC增殖，并可诱导ASMC凋亡，其机制可能与促进凋亡蛋白表达、抑制抗凋亡蛋白表达以及降低相关细胞因子水平有关。