食品中磺酰脲类除草剂的高效液相色谱分析

2019-09-18赵国栋何丰瑞秦国富

食品研究与开发 2019年18期

赵国栋，何丰瑞，秦国富

（西安市疾病预防控制中心，陕西西安710054）

磺酰脲类除草剂已广泛用于防除稻田、大豆、玉米田中的杂草，随着人们对环境污染物健康危害认识的增加，农药残留对人类健康和环境的影响受到公众广泛关注。各种磺酰脲类除草剂选择性较强，对不同作物的敏感性差异较大，因而磺酰脲类除草剂的残留会对特定的农产品产生次生药害。其次，由于磺酰脲类除草剂抗药性的作用位点单一，杂草对它们很快可产生抗药性。据国外报道，此类除草剂连续施用3年～5年后，杂草就可能产生一定的抗药性[1]。国内外对该类除草剂的多个品种规定了最大残留限量。因此，为了保护我国农民的收入和增加粮食产量，建立快速、可靠的同时检测食品中磺酰脲类除草剂多残留的方法具有一定的实际意义。

食品样品的基质通常较为复杂，磺酰脲类除草剂在其中的含量亦较低，因此，测定磺酰脲类除草剂时，通常需要进行一定的浓缩和净化处理。目前，文献报道的前处理方法主要以固相萃取（solid phase extraction，SPE）[2-5]和液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）[6]为主，其他的辅助方法有薄层析（thin-layer chromatography，TLC）和超临界萃取（supercritical fluid extraction，SFE）等[7]。测定方法主要以高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）-紫外检测和液质联用（liquid chromatography - mass spectrometry，LCMS）为主[8-11]，其主要是检测单一农药，混合农药的检测鲜有报道[2，8]。本试验选择7 种磺酰脲类除草剂作为检测对象，建立其HPLC-紫外检测分析法，并对测试条件进行详细的考察。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AKTApurifier 液相色谱仪：通用电气（中国）医疗集团；SL252 型电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；TGL-16B 型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司；CXW-170 吸油烟机：中山市黄圃镇澳洲厨具电器厂；众爱多功能食品料理机：上海众爱电器有限公司；KQ-250 型超声波清洗器：昆明市淀山湖检测仪器厂；ASH-1200-C 型艾科浦超纯水机：重庆颐洋企业发展有限公司；Supelco 固相萃取装置：北京康林科技有限责任公司。

除草剂标准：甲磺隆、苯磺隆、吡嘧磺隆，丙苯磺隆、甲磺胺磺隆（纯度均高于97.5%）：德国DR 公司；氯磺隆、苄嘧磺隆（纯度均高于97.5%）：Sigma 公司。

除草剂标准储备液：分别准确称取上述7 种除草剂标准品，用甲醇溶解配成浓度为1.00 mg/mL 标准储备液，置于-20 ℃冰箱中保存。

乙腈（色谱纯）：德国Merk 公司；甲醇（色谱纯）、盐酸（优级纯）：天津市大茂化学试剂厂。

样品：大豆、玉米、大米，均购于农贸市场。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil MPC18柱（100A0，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A 相为甲醇-乙腈（体积比 1∶1），B 相为 0.001 mol/L 盐酸，梯度洗脱程序：0～2CV，B 相为33%→2CV～3CV，B 相为 0%→3CV～4CV，B 相为 33%（CV 表示柱体积；1CV=4.155mL）；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；检测波长：220、230、240 nm；进样量：10 μL。

1.2.2 标准曲线的绘制

取一定量各除草剂的标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成浓度为 0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、100.00 μg/mL 的混合标准应用液。进样 10 μL，以待测除草剂的浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标，绘制出标准曲线或求出线性回归方程。

1.2.3 样品采集与处理

大米和玉米样品：将样品用匀浆机打碎后，称取5.0 g 左右，加入20 mL 甲醇，放入超声波清洗器超声20 min，取上清液10 mL 氮气吹干，用1 mL 甲醇溶解残渣，15 000 r/min 离心5 min 后接进样测定。

大豆样品：称取适量匀浆样品，加入20 mL 甲醇放入超声波清洗器超声20 min，取上清液10 mL 加入已活化好的C18小柱，用5 mL 甲醇分5 次洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，用1 mL 甲醇溶解残渣，150 000 r/min离心5 min 后接进样测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 测定波长的选择

根据文献报道，磺酰脲类除草剂通常在210 nm～260 nm 处有吸收峰[12]，考虑到在较低波长下检测干扰较为严重，试验在220 nm～240 nm 波长进行比较。试验结果表明，在220 nm 波长处甲磺隆和氯磺隆的灵敏度最高，在230 nm 处甲磺胺磺隆、丙苯磺隆和苯磺隆的灵敏度最高，而在240 nm 处苄嘧磺隆和吡嘧磺隆的灵敏度最高。

2.1.2 流动相的优化

由于磺酰脲类除草剂呈弱酸性，为了能使其能得到较好的峰形，通常在酸性流动相中进行色谱分离[12]。分别用一定比例甲醇-盐酸水作为流动相进行试验，氯磺隆与丙苯磺隆不能完全分离。改用一定比例的乙腈-盐酸水进行色谱分离，苯磺隆与丙苯磺隆不能完全分离。因此，试验选择流动相中有机相为乙腈和甲醇混合溶液（体积比1∶1），并在此基础上考察了有机相和盐酸水的比例，结果发现，在有机相-盐酸水体积比为67∶33 时，所有待测除草剂能达到基线分离，但吡嘧磺隆出峰时间太长，超过30 min，因此在其他除草剂出峰完全后，将有机相比例提高至100%进行冲洗，以缩短吡嘧磺隆的保留时间，在此梯度程序下混合标准分离，一次分析在20 min 内可完成。

2.1.3 流速的选择

高效液相色谱的流速与出峰时间成反比。流速越大，出峰越快，分析周期越短。试验在0.8 mL/min～1.2 mL/min范围内考察了流速磺酰脲类除草剂的影响，试验结果表明：流速在上述范围内各待测物的分离度均满足色谱分离的要求，考虑到分析时间和柱压，试验选择1 mL/min流速进行试验。在上述选择的最适色谱条件下进行分析，得到混合标准和样品色谱图，详见图1～图4。

2.2 样品处理

由于样品是颗粒性物质，直接用甲醇或乙腈提取效果较差，所以用匀浆机打碎后再提取，称取匀浆后的样品5 g 左右，分别加入20 mL 甲醇和乙腈后用超声波清洗器超声萃取20 min，考察了甲醇和乙腈的提取效率，以回收率作为考察指标，结果表明，两者提取效果相差不大，考虑到甲醇毒性较小且经济适用，故本次试验采用甲醇作为提取液。

因样品中的磺酰脲类除草剂浓度可能较低，因此进行了样品的浓缩，取甲醇提取液10 mL，氮吹仪吹干后，1 mL 甲醇溶解残渣，上清液进样分析。

图1 混合标准色谱图Fig.1 Mixed standard chromatogram

图2 玉米样品色谱图Fig.2 Chromatogram of corn sample

图3 大豆样品色谱图Fig.3 Chromatogram of soybean sample

图4 大米样品色谱图Fig.4 Chromatogram of rice sample

按上述提取和浓缩的程序进行样品处理，结果发现，大米和玉米样品干扰较少，不影响待测物的分析，而大豆样品干扰较多，部分干扰物对待测物出峰有影响。因此，用分别用液液萃取和固相萃取小柱对大豆样品进行了净化。液液萃取采取在提取液中加入一定量的正己烷进行，固相萃取采取C18小柱进行净化，比较两者的净化效果，结果表明，液液萃取效果远比C18小柱净化效果差；在此基础上，考察了C18小柱的洗脱条件，结果表明，上样后，直接用甲醇洗脱就能取到明显的净化效果。试验用1 mL～5 mL 甲醇分别进行洗脱，结果发现，用5 mL 甲醇分5 次洗脱后，样品中的待测物洗脱完全（C18小柱活化：乙腈、甲醇和水各5 mL洗脱）。

2.3 方法指标的考察

2.3.1 线性范围和检出限

在优化的分离条件下，配制不同浓度的标准应用液，进样10 μL 进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，所测定的磺酰脲类除草剂在浓度 0.5 μg/mL～100.0 μg/mL 范围内线性良好（r=0.995 5～0.999 2）；以基线3 倍噪声对应的标准溶液浓度作为方法的检出限，结果见表1。

2.3.2 精密度试验

对同一浓度的标准混合溶液，连续8 次进样测定，根据保留时间和峰面积的相对标准偏差考察精密度。试验结果如表2。