辣木提取物的制备、抗氧化活性及其在饮料中的应用

郭向阳

（茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽合肥230036）

辣木（Moringa oleifera Lam.）又称鼓槌树，奇迹之 树，白花菜目辣木科多年生热带落叶乔木，原产印度北部，适宜于热带、亚热带地区生长[1]，在我国广东、福建、广西、云南、台湾及海南诸省皆有种植，其中云南种植面积和产量最大，占中国辣木市场的三分之二[2]。辣木营养丰富，富含多种氨基酸、矿物质、维生素等人体必需营养成分，含有黄酮等天然活性成分[3-5]，具有降血糖、降脂、降压、抗炎、抗氧化及增强人体免疫力等功效[5-7]。辣木叶可食用，在印度有上千年的食用历史，2014年被国家卫生部批准为“新资源食品”。

辣木提取物是以辣木干叶为原料，经醇提或水提取后，过滤，浓缩至一定比例制备的富含辣木风味及营养成分的天然提取物，可作为天然食品添加剂应用于香精香精及食品中。辣木叶中黄酮含量较高，超过5%，是较好的黄酮类化合物的提取来源[8]。黄酮具有很强的抗氧化和消除自由基作用，既是药理因子，又是重要的营养因子，是一种新型的营养素，对人体具有重要的生理保健功效，在甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂中具有良好的溶解性[9]。辣木提取物的制备，可以以黄酮的得率作为优化指标，既保留辣木的独特风味，又可最大化的提取活性成分黄酮，增加营养价值，同时采用食用酒精作为提取溶剂，避免有毒试剂的危害，增加其可食用性和天然性，扩大应用领域，提高辣木原料的利用率，使其可作为食品、药材、添加剂等在增进营养、食疗保健、医药养生及香精香料方面得到广泛应用。但辣木的种植在国内起步较晚，对其食用价值及药理作用的认知相对较少，其食用性及营养价值亦不被消费者熟知，关于辣木提取物的制备、抗氧化活性分析，以及在饮料中的应用研究，鲜见报道。

本文拟以黄酮提取率，辣木提取物的风味特性作为判定指标，对辣木提取物的制备工艺进行优化，并对其抗氧化活性进行研究，同时对其在饮料中的应用性能进行初步探索。

1 材料与仪器

辣木：采自广东湛江，白花菜目辣木科辣木树叶，干燥后粉碎过筛（20 目），备用。

95 %食用酒精、白砂糖、食盐（氯化钠）、果葡糖浆、VC、柠檬酸、柠檬酸钠（均为食用级）、无水乙醇、NaNO2、A（lNO3）3、NaOH（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；芦丁标准品（色谱级，纯度≥98%）、1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

ME104E 分析天平：瑞士梅特勒仪器有限公司；DK-S22 电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；ST16 高速离心机：美国赛默飞世尔科技公司；GM-0.33A 隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；R-210 旋转蒸发仪：瑞士步琦公司；UV-2450 紫外可见分光光度计：日本岛津仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 辣木提取物制备

准确称取辣木样品50 g 置于500 mL 烧杯中，以一定液料比向烧杯中加入不同浓度的食用酒精，混合均匀后，烧杯口上端连接球形冷凝管，经保鲜膜密封烧杯缺口，于一定温度下（恒温水浴锅）浸提一定时间，取出样品迅速冷却至室温（25 ℃）后抽滤，滤液备用；收集滤渣于烧杯中，依试验设计需要，以上述参数重复浸提，抽滤，合并数次滤液，经旋转蒸发仪浓缩至原料质量的 1 倍，离心（8 500 r/min，15 min）后收集上清，回填旋蒸冷凝液至50 g，得辣木提取物样品，4 ℃冷藏备用。辣木提取物中黄酮含量的测定采用铝络合分光光度法，以芦丁作为黄酮对应标准品建立标准曲线进行定量。每组提取试验进行3 次重复，采用单因素方差分析进行数据显著性统计分析，以p＜0.05 作为数据显著性指标。

2.2 黄酮定量标准曲线的建立

准确称取芦丁标准品0.050 g，用无水乙醇溶解，定容至50 mL，配制成1 mg/mL 的芦丁标准液备用[10]。

准确吸取芦丁标准液 0、10、30、50、100、150、200 μL于10 mL 容量瓶中，再分别加入0.2 mL 5%NaNO2溶液，摇匀，放置5 min 后加入0.2 mL 10%Al（NO3）3溶液，5 min 后再加入 2.5 mL 1 mol/L 的 NaOH 溶液，混匀，加入无水乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min 后，以无水乙醇做空白对照，于510 nm 处测定其吸光度，以芦丁浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准溶液质量浓度与吸光值的回归曲线，得到回归方程为y=0.033 6x+0.003 2（x 为芦丁浓度，范围为1 μg/mL＜x＜30 μg/mL，y 为吸光度），R2=0.998 5，如图 1所示。

图1 黄酮含量的标准曲线Fig.1 Standard curve of flavonoid content

2.3 辣木提取物黄酮含量的测定

吸取1 mL 辣木提取物于10 mL 的容量瓶定容，依2.2 法所示于510 nm 处测定吸光度，通过回归方程和稀释倍数计算辣木提取物中的黄酮含量，计算方法如下：

2.4 辣木提取物抗氧化活性研究

准确称取0.004 g DPPH，无水乙醇溶解后定容至100 mL，配制成0.1 mmol/L 的DPPH 自由基工作液备用[8-9]。

以优化制备的辣木提取物为供试原料，无水乙醇溶解后制成不同浓度梯度（0.01、0.02、0.03、0.10、0.20、0.33、1.00、10.00 mg/mL）的样品，然后吸取 0.2 mL 不同浓度的辣木提取物加入到2.8 mL DPPH 自由基工作液，避光反应30 min，在517 nm 波长处测定吸光值，计算其清除率。试验重复3 次。

式中：A0为空白；Ai为样品反应体系；Aj为反应前提取液样品。

2.5 辣木提取物在饮料中的应用

以优化制备的辣木提取物作为供试原料，对其风味特性进行基础评价和判断，而后选取适宜的饮料基础配方，制取饮料基础液，添加一定比例辣木提取物于饮料基础液中，分别从饮料澄清度、口感顺滑度、香气舒适度及风味稳定性等四方面对辣木提取物饮料进行评价。

3 结果与分析

3.1 辣木提取物制备优化

以辣木提取物中黄酮得率为主要指标，兼顾其风味特征，考察提取次数、提取温度、酒精浓度、液料比和提取时间等因素对辣木提取物的影响，在前期提取物制备经验基础上，对提取参数范围进行择选，优化辣木提取物的浸提条件。

3.1.1 提取次数对辣木提取物的影响

在提取温度60℃、酒精浓度60%、液料比10∶1（mL/g）、提取时间 2.5 h 条件下，考察不同提取次数（1、2、3、4）对辣木提取物中黄酮得率的影响。试验结果如图2所示。

由图2 可知：提取次数越多，黄酮的得率越高；但是次数多于3 次时，提高幅度变小，不具有显著性，同时提取次数越多，增加了色素、生物碱类物质的溶出，降低了辣木提取物的风味特性，加重了后期浓缩的负担，亦导致浓缩过程中风味物质的过度损失。结合实际生产效率和能耗，提取2 次为宜。

图2 提取次数对辣木提取物中黄酮得率的影响Fig.2 Effects of extraction times on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

3.1.2 提取温度对辣木提取物的影响

在浸提 2 次、酒精浓度 60%、液料比 10∶1（mL/g）、提取时间2.5 h 条件下，考察不同提取温度（25、30、40、50、60 ℃）对辣木提取物中黄酮得率的影响。试验结果如图3 所示。

图3 提取温度对辣木提取物中黄酮得率的影响Fig.3 Effects of extraction temperature on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

由图3 可知：提取温度为40 ℃时，黄酮的得率最高。随着提取温度的升高，黄酮从基质中溶出的速度增加，黄酮的得率也逐渐增加，但40 ℃以后，相对高的温度会导致体系中其它非挥发性物质的溶出，同时可能导致黄酮结构的改变，因此其得率呈下降趋势，而且在中低温度下，辣木提取物具相对真实的风味特征，不具有高温下的蒸煮味等不良风味。结合产品特性及生产的实际情况，节省能耗，提取温度设置为40 ℃。

3.1.3 酒精浓度对辣木提取物的影响

在提取 2 次、提取温度 40 ℃、液料比 10∶1（mL/g）、浸提时间2.5 h 条件下，考察不同酒精浓度（0、20、40、60、80、95%）对辣木提取物中黄酮得率的影响。

图4 酒精浓度对辣木提取物中黄酮得率的影响Fig.4 Effects of ethanol concentration on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

图4 所示，酒精浓度在20%～40%时，黄酮的得率有最高值。黄酮难溶于水，易溶于酒精，随着酒精浓度的增加，增加了黄酮在溶剂中的溶解性，黄酮的得率呈上升趋势，但随着酒精浓度的继续增大，会加大其它脂溶性物质的溶出，形成竞争性提取，而导致黄酮得率的降低。同时高酒精浓度下的辣木提取物，醇味过于透发，在头香中聚集，而且酒精易挥发的特性易带走提取物中的部分挥发性成分，造成风味损失，不利于贮存和运输。实际生产中，建议酒精浓度为30%。

3.1.4 液料比对辣木提取物的影响

在提取2 次、提取温度40 ℃、酒精浓度30%、浸提时间 2.5 h 条件下，考察不同液料比[2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1（mL/g）]对辣木提取物中黄酮得率的影响。实验结果如图5 所示。

图5 液料比对辣木提取物中黄酮得率的影响Fig.5 Effects of liquid to material ratio on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

由图5 可知，黄酮的得率随着提取溶剂量的增加，先升高后下降。随着提取溶剂量的增加，增大了黄酮在介质中的溶出速度，其得率逐渐增大，在液料比为8∶1（mL/g）时，黄酮得率最高，而后降低，可能是随着提取溶剂量的增加，单位体积内黄酮的量逐渐减少，传质的速度变慢或降低所致。在液料比为6∶1（mL/g）至 8∶1（mL/g）过程中，黄酮得率增加相对缓慢，两者风味无明显差异，因此在实际生产中，考虑到能耗、生产成本及生产实际，选取液料比为6∶1（mL/g）。

3.1.5 浸提时间对辣木提取物的影响

工科新教师培训实践偏离的原因较为复杂，既有学校政策制度的影响又有学校管理体制与机制的制约，既有新教师个体培训动力不足又有培训组织实施不到位等原因。

在提取2 次、提取温度40 ℃、酒精浓度30%、液料比 6∶1（mL/g）条件下，考察不同提取时间（1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h）对辣木提取物中黄酮得率的影响，如图6 所示。

图6 提取时间对辣木提取物中黄酮得率的影响Fig.6 Effects of extraction time on flavonoid content in Moringa oleifera extracts

由图6 可知，黄酮的得率随着提取时间的延长而逐渐升高，提取时间大于2 h，升高速度变缓。2 h～3 h对辣木黄酮的提取相对完全，时间过长易导致辣木提取物中蒸煮味的产生，综合考虑提取效率、生产效益，以及风味特性，选取提取时间为2 h。

综合以上优化因素，辣木提取物的提取条件为：40 ℃的提取温度下，6∶1（mL/g）的液料比，以 30%的食用酒精作为提取溶剂，提取2 次，每次提取2 h。在此条件下制备辣木提取物，并进行验证试验。3 次提取的辣木提取物中黄酮得率的平均值为（5.79±0.03）%，高于优化中的各组，同时提取物中辣木特征风味凸出，醇味较轻，无蒸煮味，风味特性较好。

3.2 辣木提取物的抗氧化活性分析

将优化后制备的辣木提取物作为供试原料，利用DPPH 法研究其体外清除DPPH 自由基的能力，对其抗氧化活性进行初步研究。辣木提取物的浓度与DPPH 自由基清除率通过方程拟合得到的拟合曲线及拟合方程见图7。

通过上图拟合方程，得到辣木提取物清除DPPH自由基的EC50=0.46 mg/mL。由此可见，辣木提取物具有极强的清除DPPH 自由基的能力，具有较强的抗氧化活性[11]，可作为潜在的抗氧化剂使用。

图7 辣木提取物黄酮含量对DPPH 自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of flavonoids from Moringa oleifera extracts on DPPH free radical

3.3 辣木提取物饮料应用

鲜嫩辣木叶具新鲜的蔬菜风味，青味透，似菠菜口感，具辛辣味，味微苦，直接食用会难以下咽[12]，但优化制备的辣木提取物摒弃了辣木叶的青味，具清香和似茶的风味，微涩而少苦，因此可考虑以茶饮料的基础配方（35 g 白砂糖，60 g 的果葡糖浆，1.0 g 的柠檬酸，0.2 g 的 VC，0.3 g 的柠檬酸钠，0.1 g 的食盐，用纯净水溶解完全，定容至1 L）进行辣木提取物饮料的适配和调制。

表1 辣木提取物饮料的感官评价Table 1 Sensory evaluation of moringa extracts beverage

经过8 位专业饮料研发人员的感官评价，综合各评价指标及2 h 风味稳定性结果，0.5%的辣木提取物添加到茶饮料基础液中，能获得有厚度，滋味鲜爽而回甘，具顺滑口感、柔和的清香和叶香的应用产品，且饮料澄清度较好，香气持久而扬，无絮状或悬浮颗料出现，0.5%的添加比例较适合，特征风味透发，产品相对稳定。

4 结论与讨论

对辣木提取物的制备进行了小试优化，提取温度40 ℃，液料比 6∶1（mL/g），以 30%的食用酒精作为提取溶剂，提取2 次，每次提取2 h，辣木提取物黄酮得率为（5.79±0.03）%，高于选取的单因素条件下的各组，为工业化中试生产提供参数借鉴和参考，在此条件下制备的辣木提取物具柔和的清香和叶香，鲜而微涩，有回甘，醇味较淡，但提取物有苦涩感，微腥而具青味，可能与其中含有的生物碱类、色素类物质有关。利用DPPH 试验对辣木提取物清除自由基的能力进行了研究，辣木提取物清除DPPH 自由基的EC50=0.46 mg/mL，抗氧化活性较好。同时对辣木提取物在饮料中的应用进行了初探，可以较好的跟茶饮料基础液进行融合和复配，适制产品具柔和的清香，淡而微鲜爽，澄清透明，稳定性较好，0.5%的添加比例较为合适。后期可对提取物进行纯化和精制，最大化的获取其营养及健康组分，对其苦、涩味进行修正，保留其清香、鲜爽的风味，同时对其在饮料中的应用进行更为细致的研究和探索，为辣木提取物工业化生产及在饮料、保健品方向上的应用提供数据支撑和参考。