大蒜及黑蒜多糖含量测定和抗氧化活性研究

杜瑞雪，王丽丽，张畅，李善姬，*

（1.吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132013；2.延边大学医学院，吉林延吉133002）

我国著名药典《本草纲目》详细描述了大蒜健脾、解毒、消炎等作用，大蒜含有丰富的营养成分，包括氨基酸，糖类，维生素，微量元素等。大蒜中有17 种氨基酸[1]，微量元素硒含量丰富[2]，有效成分主要为含硫化合物，蒜氨酸和蒜酶以及大蒜破坏后产生的大蒜素[3]，黑蒜又称黑大蒜，是由带皮的新鲜大蒜在一定的环境下，不使用任何添加剂或其他化学制剂，自然发酵而成，其黑变过程发生的是Maillard 反应[4]，发酵后的黑蒜味道酸甜，无刺激性气味，黑蒜与大蒜相比，抗氧化、抗酸化功效不仅提高了数十倍，又把大蒜本身的蛋白质大量转化成为人体每天所必需的多种氨基酸，生物有效成分及生理功能明显提高[5]，主要有抗氧化作用[6]、防癌抗癌作用[7]、胃肠道保护作用[8]、调节血糖水平[9]以及改善记忆力的功能[10]。

多糖是参与机体供能的营养物质，也参与维持机体的多种生理功能，大蒜多糖是大蒜的主要成分，药理研究显示大蒜多糖具有抗凝血、降血脂和预防动脉粥样硬化等生理功能[11]，资料报道大蒜多糖还具有抗糖尿、保护肝功能、抗肿瘤和预防衰老等作用[12-13]。经发酵的黑蒜营养成分发生了变化，但黑蒜多糖的研究匮乏，越来越多的医学研究证明，许多慢性疾病包括心血管、内分泌、胃肠道等方面的疾病以及白内障、衰老和各类癌症等，都与氧自由基的产生有关[14]，机体代谢会产生少量自由基，人体内有抑制自由基反应的体系，如果遭到破坏，则会导致细胞损伤[15]。祝炳俏等[4]最早运用动物实验说明黑蒜的抗氧化作用明显好于大蒜，Sun YE 等[16]优化了黑蒜的发酵条件，保持75 ℃温度和相对湿度85%发酵8 d，发酵的黑蒜保留了理想的抗氧化能力和丰富的营养，测定其自由基清除能力变化，结果显示黑蒜清除自由基的能力显著强于大蒜，这对研究高效、无毒副作用的天然抗氧化物质有重要意义。本研究从测定黑蒜多糖含量及抗氧化活性出发来研究黑蒜的营养价值，为开发功能食品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大蒜：云南大理；苯酚、无水乙醚、正丁醇、无水乙醇、氯仿、硫酸、盐酸、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲、邻苯三酚：均为分析纯，天津市凯信化学工业有限公司；无水葡萄糖、水杨酸、抗坏血酸、过氧化氢：均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；活性炭（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。

发酵锅（DHC-7000C）：韩国Dorim；电热恒温干燥箱（202-1A 型）：天津市泰斯特仪器有限公司；分析天平（FA1104N）：上海精密科学仪器有限公司；原子吸收分光光度计（6810 型）：上海森谱科技有限公司；旋转蒸发仪（RE-52A 型）：上海亚荣生化仪器厂；循环水式多用真空泵（SHB-111A 型）：上海豫康科教仪器设备有限公司；漩涡混合器（MVS-1 型）：北京金北德工贸有限公司；中药粉碎机（AF-20A 型）：温岭市奥力中药机械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验材料处理

将大蒜去皮、洗净放入发酵锅内30 h 即可制得黑蒜，将大蒜和黑蒜干燥至恒重，粉碎，过40 目筛，贮存备用。再将干燥的黑蒜、大蒜粉末，分别用滤纸包成包，放到索氏提取器中，使用乙醚进行脱脂，回流至滤液呈无色透明，干燥备用。

1.2.2 多糖的提取

料液比 1∶30（g/mL）配液→热水浸提（时间 2.25 h，提取温度75.3 ℃[17]）→4 层纱布过滤得滤液→活性炭脱色→离心取上清→上清液浓缩→去蛋白（Sevag 方法振荡去除）→醇沉24 h→烘干备用。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚-硫酸法，精确移取葡萄糖1 mg/mL 对照储备液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，定容至100 mL，制成不同浓度的标准溶液。移取2.0 mL 标准液加入6 %苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，于40 ℃水浴中显色 40 min，冷却至 22 ℃～25 ℃后，用分光光度仪在490 nm 波长处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，并得出标准曲线的回归方程。

1.2.4 多糖含量测定

制作大蒜、黑蒜多糖供试液，用苯酚-硫酸法测定吸光度，平行测定3 次，根据回归方程计算多糖含量。根据公式（1）计算多糖含量。

式中：c 为多糖溶液中葡萄糖的浓度，mg/mL；v 为样品提取时的定容体积，mL；n 为稀释倍数；m 为大蒜/黑蒜的质量，g。

1.2.5 DPPH 自由基清除率的测定

采用改进的Nagai 法[17]，取各浓度多糖样品液，加入DPPH 60%乙醇溶液4 mL，混匀，放置30 min。于波长517 nm 处测定吸光度值，平行测定3 次。根据公式（2）计算自由基清除率：

式中：Ai为样品与自由基反应后的吸光度；Ac表示空白对照的吸光度。

1.2.6 羟自由基清除率的测定

取样品液于具塞比色管中，按顺序依次加入6 mmol/L FeSO4，6 mmol/L 水杨酸 1 mL，充分摇匀后加入6 mmol/L H2O21 mL 启动反应，37 ℃水浴1 h，于波长510 nm 处测定各管的吸光度值，平行测定3 次，根据公式（3）计算抑制率：

式中：Ai表示样品与自由基反应后的吸光度；Ac表示空白对照的吸光度。

1.2.7 超氧阴离子自由基清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法，不同浓度样品液加入2.4 mL Tris-HCl 缓冲液（pH 8.2），混匀，预热后加入0.1 mL 7 mmol/L 的邻苯三酚开始反应，后加入1 滴10 mol/L 的浓盐酸终止反应，随后在325 nm 处测定体系的吸光度值，平行测定3 次，根据公式（4）计算抑制率：

式中：Ai表示样品与自由基反应后的吸光度；Ac表示空白对照的吸光度。

1.3 统计学处理

所有试验数据数据处理采用Excel 数据库录入数据并用SPSS 20.0 软件进行分析，结果以表示，以P＜0.05 为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定

绘制葡萄糖标准曲线，得线性回归方程为：y=10.743x-0.006，R2=0.999 1，测得大蒜和黑蒜吸光度数值，结果见表1。

根据标准曲线和回归方程计算出大蒜多糖的含量为50.33 mg/g，黑蒜多糖的含量为98.67 mg/g。大蒜在发酵成黑蒜过程中，发生美拉德反应，颜色变黑，黏度和糖分增加，口感变得软绵酸甜，经测定多糖含量，可以确定，增加的有效物质为多糖。本试验用的是水提醇沉法提取多糖，此种方法比水提取法提取的多糖含量高，试验材料简单易得，控制了温度和醇沉时间，得到最佳提取方法。

表1 黑蒜和大蒜的多糖样品液吸光度值Table 1 The absorbance value of black garlic and garlic polysaccharide

2.2 DPPH 自由基清除率测定结果

DPPH 自由基有机溶液常温下呈紫色，在波长517 nm 处有最大吸光度，通过分光光度法测定吸光度的降低来监测样品自由基清除能力。黑蒜和大蒜多糖对DPPH 自由基的清除率见表2、图1。

由表2、图1 结果可知，各样品的DPPH 自由基清除率与用量均显示正相关，VC组显示了较强的清除率，并保持在96%左右。大蒜组的清除率在低浓度200 μg/mL 时，为 9.31%，用量增加到 1000 μg/mL 后，清除率达到28.47%，低于对应的VC组。黑蒜组的清除率在低浓度200 μg/mL 时为42.24 %，用量增加到1 000 μg/mL 后，清除率达到79.21%，同样低于对应的VC组。统计学结果显示对应浓度下，黑蒜、大蒜和VC组比较，均有P＜0.01，抗氧化能力VC＞黑蒜＞大蒜。

表2 黑蒜和大蒜多糖对DPPH 自由基的清除作用（，n=3）Table 2 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on DPPH（，n=3）

表2 黑蒜和大蒜多糖对DPPH 自由基的清除作用（，n=3）Table 2 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on DPPH（，n=3）

注：* 表示与 VC 组比较，P＜0.01，# 表示与大蒜组比较，P＜0.01。

各样品不同浓度下样品的清除率/%200 μg/mL 400 μg/mL 600 μg/mL 800 μg/mL 1000 μg/mL VC 95.01±0.006 2 95.59±0.007 0 96.22±0.006 1 96.49±0.006 2 97.30±0.008 4大蒜 9.31±0.007 0* 10.79±0.008 4* 20.11±0.006 1* 24.70±0.010 7* 28.47±0.010 2*黑蒜 42.24±0.008 4*# 53.17±0.008 4*# 65.99±0.007 0*# 73.68±0.010 7*# 79.21±0.010 1*#

图1 黑蒜和大蒜多糖对DPPH 自由基的清除率Fig.1 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on DPPH

2.3 羟自由基清除率结果

羟自由基具有极强的氧化能力，在体内主要由过氧化物负离子和过氧化氢反应生成，加入水杨酸反应，生成有特殊吸收的2，3-二羟基苯甲酸，如果向反应体系中加入具有清除羟自由基功能的样品，就会减少生成的羟自由基，固定反应时间，在510 nm 处测样品的吸光度，结果见表3、图2。

由表3、图2 结果可知，各样品的·OH 清除率与用量均显示正相关，VC组显示了较强的清除率，最高浓度时为90.15%。大蒜组的清除率在最低浓度200 μg/mL时为4.08%，最高浓度1 000 μg/mL 时为20.02%。黑蒜组的清除率在最低浓度200 μg/mL 时为5.70%，最高浓度1 000 μg/mL 时为27.55%。对应浓度下，黑蒜、大蒜和VC组比较，均有P＜0.01，抗氧化能力VC＞黑蒜＞大蒜。

表3 黑蒜和大蒜多糖对羟自由基的清除作用（，n=3）Table 3 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on hydroxyl radical（，n=3）

表3 黑蒜和大蒜多糖对羟自由基的清除作用（，n=3）Table 3 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on hydroxyl radical（，n=3）

注：* 表示与 VC 组比较，P＜0.01，# 表示与大蒜组比较，P＜0.01。

各样品不同浓度下样品的清除率/%200 μg/mL 400 μg/mL 600 μg/mL 800 μg/mL 1000 μg/mL VC 30.91±0.002 6 41.99±0.001 8 63.42±0.002 0 87.02±0.003 5 90.15±0.003 2大蒜 4.08±0.002 4* 4.85±0.002 0* 9.17±0.002 1* 18.49±0.002 1* 20.02±0.002 5*黑蒜 5.70±0.002 1*# 7.22±0.002 1*# 13.31±0.003 4*# 23.97±0.003 8*# 27.55±0.003 9*#

图2 黑蒜和大蒜多糖对羟自由基的清除率Fig.2 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on hydroxyl radical

2.4 超氧阴离子自由基清除率结果

超氧阴离子自由基作为人体内存在的自由基，与羟基（-OH）结合后的产物会导致细胞DNA 损坏，与人体某些疾病密切相关。邻苯三酚自氧化可产生O2-·，在pH＜9.0 时，邻苯三酚自氧化速率与生成的O2-·的浓度呈正相关，通过分光光度计测定吸光度来测定对自由基的清除能力，间接评价抗氧化能力。多糖对超氧阴离子自由基的清除率见表4、图3。

表4 黑蒜和大蒜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用（，n=3）Table 4 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on superoxide anion（，n=3）

表4 黑蒜和大蒜多糖对超氧阴离子自由基的清除作用（，n=3）Table 4 The radical scavenging activity of black garlic and garlic polysaccharide on superoxide anion（，n=3）

注：* 表示与 VC 组比较，P＜0.01，# 表示与大蒜组比较，P＜0.01。

各样品不同浓度下样品的清除率/%200 μg/mL 400 μg/mL 600 μg/mL 800 μg/mL 1 000 μg/mL VC 55.85±0.008 6 75.16±0.008 6 81.50±0.011 7 93.30±0.007 1 96.78±0.107大蒜 6.79±0.015 7* 8.04±0.007 1* 13.49±0.005 6* 19.66±0.108* 22.24±0.008 2*黑蒜 34.13±0.005 5*# 39.40±0.007 11*# 51.65±0.179*# 74.62±0.017 8*# 78.02±0.010 7*#

由表4、图3 结果可知，各样品的O2-·自由基清除率与用量均显示正相关，VC组显示了较强的清除率，最高浓度时为96.78 %。大蒜组的清除率在低浓度200 μg/mL 时，为 6.79%，用量增加到 1 000 μg/mL 后，清除率达到22.24%，低于对应的VC组。黑蒜组的清除率在低浓度200 μg/mL 时为34.13%，用量增加到1 000 μg/mL 后，清除率达到78.02%，也低于对应的VC组。对应浓度下，黑蒜、大蒜和VC组比较，均有P＜0.01，抗氧化能力VC＞黑蒜＞大蒜。

3 结论与讨论

随着时代发展及生活水平的提高，人们更加注重健康生活，纯天然、无毒副作用的天然化合物的开发和利用成为学者们研究的热门话题，多糖存在很多天然植物中，是参与生命活动的基本物质之一，与维持多种生理功能密切相关。黑蒜是由新鲜大蒜在适当条件下发酵而成，比普通大蒜具有更高的抗氧化能力，可以增强人体免疫力、对抗疲劳[18]。目前对黑蒜多糖相关研究还不多，本研究采用传统水提醇沉法提取大蒜及黑蒜中的多糖，对大蒜和黑蒜的多糖含量和抗氧化活性进行了研究，结果表明，黑蒜、大蒜对DPPH 自由基、羟自由基、超阳阴离子自由基均显示抗氧化能力，并均具有量效关系。黑蒜多糖比大蒜多糖具有更强的抗氧化作用，但其抗氧化性低于维生素C。黑蒜作为大蒜的一种新型炮制品具有更多的药用和食用价值，应进一步研究和制定其质量标准，进行安全性评价，为新食品原料申请提供科学依据。