p62、p16和Ki-67在乳腺癌中的表达及临床意义

周成美 程新宇

(1锦州医科大学第三临床学院2015级本科生，辽宁 锦州 110032；2沈阳医学院附属中心医院病理科)

研究发现〔1〕乳腺癌的发生是多因素共同参与、多个分化阶段及多基因表达水平异常的复杂过程。自噬可清除受损的细胞器抑制肿瘤形成，而自噬缺陷可以导致肿瘤的发生，自噬相关蛋白p62由C-Myc编码，在细胞质中合成定位于细胞核的一种多功能泛素化结合蛋白〔2〕，具有选择性自噬功能在一定程度上反映了自噬活性〔3〕。抑癌基因p16是细胞周期调控因子，其失活及突变与多种肿瘤发生及发展密切相关。增殖指数(Ki-67)是细胞增殖的重要标志，常可作为预测恶性肿瘤发展及预后的指标。本文主要应用免疫组织化学SP法检测乳腺癌及癌旁正常乳腺组织及乳腺良性肿瘤中p62、p16和Ki-67表达差异，探讨三者与患者临床病理特征的关系，为乳腺癌治疗及预后提供新的研究靶点。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取2016年1月至2017年12月沈阳医学院附属中心医院病理科79例乳腺癌标本(乳腺癌组)和20例相应距肿瘤组织5 cm以上的癌旁正常乳腺组织及乳腺良性肿瘤标本(对照组)。乳腺癌组中三阴乳腺癌39例，非三阴乳腺癌40例。所有患者临床病理资料存档完整。患者年龄30～78岁，中位年龄58岁；肿瘤直径≤2 cm 26例，肿瘤直径>2 cm 53例；组织学分级Ⅰ级2例，Ⅱ级54例，Ⅲ级23例；有淋巴结转移33例，无淋巴结转移46例。患者经免疫组织化学检测时均未经放化疗。

1.2主要试剂 通用型p62鼠抗人单克隆抗体购自美国Abcam 公司；p16、Ki-67、雌激素受体(ER)和SP试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3免疫组织化学SP法染色 乳腺癌患者肿物切除后均使用10%的中性甲醛固定，依据病理规定规范取材，石蜡包埋，4 μm连续切片，常规石蜡脱水，抗原高压修复，室温冷却30 min；每张切片均按照免疫组化SP法操作流程制作，DAB显色，镜下观察后自来水冲洗，苏木素复染，磷酸盐缓冲液(PBS)或自来水冲洗返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明后，中性树胶封固。使用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性乳腺癌标本切片作阳性对照。

1.4结果判读 免疫组化切片均由两位经验丰富的病理科医师采用双盲法单独判读。p62 阳性结果判读标准：p62阳性表达为出现棕黄色颗粒定位于细胞质。p16阳性判断标准：阳性表达定位于细胞质。Ki-67阳性判断标准：阳性表达定位于细胞核。在高倍镜下任意计数5个视野，每次选取200个细胞进行观察，按阳性细胞所占百分比计分，评分标准为〔4〕:0分为无阳性细胞；1分为阳性细胞<10%；2分为阳性细胞10%～30%；3分为阳性细胞>30%。按染色强度计分：不着色为0分；淡黄色计1分；黄色计2分；棕黄色计3分。阳性细胞百分比计分与染色强度计分的乘积:0～2分为阴性，3～9分为阳性。ER阳性结果判断标准：ER阳性表达定位于细胞核。

1.5统计学分析 应用SPSS17.0软件进行χ2检验、Pearson相关分析。

2 结 果

2.1p62、p16和Ki-67在乳腺组织中表达 乳腺癌组p62阳性表达位于细胞质，呈棕黄色(图1、2)，三阴乳腺癌阳性表达率为69.2%(27/39)、非三阴乳腺癌阳性表达率为47.5%(19/40)，乳腺癌组58.2%(46/79)明显高于对照组〔10%(2/20)〕，差异有统计学意义(χ2=6.487,P<0.05)；乳腺癌组p16阳性表达位于细胞质，呈棕黄色(图3、4)，三阴乳腺癌阳性表达率为71.1%(28/39)、非三阴乳腺癌阳性表达率为42.5%(17/40)，乳腺癌组〔56.9%(45/79)〕明显高于对照组〔5%(1/20)〕，差异有统计学意义(χ2=8.815,P<0.01)；乳腺癌组Ki-67阳性表达位于细胞核，呈棕黄色(图5、6)，三阴乳腺癌阳性表达率为76.9%(30/39)、非三阴乳腺癌阳性表达率为27.5%(11/40)，乳腺癌组〔51.8%(41/79)〕明显高于对照组〔5%(1/20)〕，差异有统计学意义(χ2=7.389,P<0.01)。

图2 乳腺癌免疫组化p62阴性表达(×100)

图3 乳腺癌免疫组化p16细胞质强阳性表达(×100)

图4 乳腺癌免疫组化p16阴性表达(×100)

图5 乳腺癌免疫组化Ki-67细胞核阳性表达(×100)

图6 乳腺癌免疫组化Ki-67阴性表达(×100)

2.2p62、p16和Ki-67表达与临床病理特征的关系 p62阳性表达与组织学分级和淋巴结转移相关，差异有统计学意义(P<0.05)；p16和Ki-67阳性表达与组织学分级相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3p62、p16和Ki-67表达与ER的关系 乳腺癌组p62、p16、Ki-67阳性表达与ER呈显著负相关(P<0.05)。见表2。

2.4p62、p16和Ki-67相关性分析 乳腺癌组p62和Ki-67表达呈显著正相关(P<0.01)；p16和Ki-67表达呈显著正相关(P<0.05)；p62和p16表达无相关性(P>0.05)。见表3。

表1 p62、p16和Ki-67表达与乳腺癌临床病理特征的关系(n)

表2 p62、p16和Ki-67表达与ER的关系 (n)

表3 乳腺癌中p62、p16和Ki-67的相关性(n)

3 讨 论

自噬是一种进化保守、亚细胞水平的自我吞噬，自噬基因的异常表达与一些肿瘤的形成密切相关。自噬相关蛋白p62是一种支架蛋白。自噬发生时，p62首先与细胞质中泛素化蛋白结合，再与定位于自噬体内膜上微管相关蛋白轻链3(LC3B)形成复合物，被自噬溶酶体降解。自噬过程中，p62蛋白在细胞质中不断被降解，自噬被抑制时，p62蛋白在细胞质中不断积累，因此p62可作为反映自噬活性的标记蛋白〔5〕。本实验结果显示，p62蛋白在乳腺癌细胞质中表达明显高于癌旁正常乳腺组织及乳腺良性肿瘤，p62在乳腺癌异常聚集表明自噬活性显著减弱，自身受损、变性或衰老细胞器和大分子物质得不到及时降解，导致活性氧大量产生，使乳腺正常组织DNA损伤，促使正常乳腺组织向癌进一步转化。

p62蛋白在乳腺癌表达与临床病理学参数关系的文献鲜有报道。本实验显示，p62蛋白表达与组织学分级及淋巴结转移相关，表明p62阳性表达与肿瘤的恶性行为相关，其高表达预示乳腺癌恶性程度高，易发生转移，是预后差的指标。Burdelski等〔6〕使用免疫组化技术检测了前列腺癌组织中p62的表达，发现其表达与组织学分级及淋巴结转移有关，其研究结果与本实验结果相似。

p16抑癌基因控制细胞分裂的原理是在G1卡点中，与细胞周期中Cyclin D1发生竞争，结合并且抑制CDK4活性，从而阻止细胞特别是损伤DNA的细胞进入S期〔7，8〕，其异常表达表现为过表达或表达下调。有研究〔9〕提出p16的过表达在恶性程度高的肿瘤中作用更突出，乳腺癌中可较多出现过表达。亦有文献报道〔10〕在乳腺癌中会出现p16下调。

本实验结果显示，p16蛋白在乳腺癌细胞质中弥漫强阳性表达，明显高于癌旁正常乳腺组及乳腺良性肿瘤。提示p16高表达可能与乳腺癌发生、发展具有一定的相关性，并且在三阴乳腺癌中高表达，预示p16有可能成为三阴乳腺癌的检测指标。

本实验显示，p16蛋白表达与组织学分级相关，表明p16阳性表达与肿瘤的恶性行为相关，其高表达预示乳腺癌恶性程度高，易发生转移，是预后差的指标。

Ki-67是一种与细胞增殖密切相关核抗原，是评价恶性肿瘤细胞增殖程度最可靠的指标。本研究结果表明，在乳腺癌组织中Ki-67阳性表达定位于细胞核，与癌旁正常乳腺组织及乳腺良性肿瘤表达差异显著，Ki-67与组织学分级显著相关，因此，在乳腺癌组织中Ki-67的高表达可提示肿瘤细胞增殖活跃，侵袭力强，易发生转移，预后较差。

p62、Ki-67呈显著正相关表明两者共同促进肿瘤发生，在乳腺癌中两者高表达预示了肿瘤恶性程度高，侵袭力强，易发生转移；

ER的缺失与p16的异常表达相关，p16的异常表达在低分化的癌组织阳性率高，与ER表达呈负相关，与Ki-67的表达正相关〔11〕，与本研究结果一致，提示p16有可能成为乳腺癌恶性程度及判断预后有力检测指标之一。

综上所述，乳腺癌组织中存在着p62和Ki-67过度表达及p16蛋白异常表达，p62、p16和Ki-67可成为判断乳腺癌组织分化程度及预后的实验室指标。