人类表皮生长因子受体2和拓扑异构酶Ⅱα在结肠癌中的表达及意义

王月华 蒋林哲 鞠晓红 李强 李瑶 钟秀宏

(1吉林医药学院检验学院病原技术教研室，吉林 吉林 132013；2吉林市人民医院普通外科；3吉林医药学院基础医学院病理教研室)

结肠癌是人类最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年攀升〔1〕，近年来已跃升为我国消化道第二大恶性肿瘤。因结肠癌缺乏早期特征性表现，常发展至中晚期才被发现，导致预后不佳，而早发现早治疗是改善其预后的重要因素。因此，寻找新的可用于早期诊断和判断预后的生物学标志物,成为结肠癌当前的研究热点。研究表明，人类表皮生长因子受体(HER)2和拓朴异构酶(TOPO)Ⅱα扩增和过度表达参与了多种肿瘤发生及转化〔2～5〕。目前国内关于结肠癌患者HER2和TOPOⅡα研究报道不尽相同，且多采用免疫组化法检测，而血清中此两种蛋白表达水平研究鲜见报道。本文旨在探讨结肠癌患者血清HER2和TOPOⅡα含量与结肠癌发生的关系。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取吉林市人民医院普外科2017年6月至2018 年3月行手术切除的结肠癌患者45例作为结肠癌组，男26例，女19例，年龄60～75岁，平均(67.13±4.429)岁。正常组织对照取自结肠外伤手术组织12例为健康对照组1，男、女各6例，年龄60～69岁，平均(64.42±2.937)岁。正常血清对照为本院体检中心进行体检的健康人员45例为健康对照组2，男31例，女14例，年龄60～75岁，平均(66.33±4.178)岁。3组性别构成、年龄差异不显著(P>0.05)。

1.2标本收集 术前于清晨空腹，经受试者肘静脉采血3 ml，置于干燥无抗凝剂的试管中。室温静置0.5～1.0 h后，3 000 r/min离心5 min，取血清置于EP 管，存放于-80℃冰箱中备用；同时选取对应患者的结肠癌组织标本和健康对照组1组织标本，患者术前未经抗肿瘤治疗，术后均经病理确诊，病例均未同时患有其他恶性肿瘤，样本均立即置10%甲醛液内固定。

1.3实验方法 采用双抗体夹心法定量检测血清中HER2和TOPOⅡα的含量，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自鼎国试剂公司，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，于反应结束后，450 nm波长，空白对照孔调零后测各孔OD值，得出OD值绘制标准曲线，算出相应的水平值。对结肠癌组织和正常结肠组织分别行MaxVision免疫组织化学方法定性检测HER2和TOPOⅡα的表达。HER2和TOPOⅡα的阳性染色表达均为大小不一的黄色或棕黄色颗粒，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞的百分比和阳性细胞着色强度两项指标来判定结果。根据染色评分+阳性细胞比评分=总分数,随机选择10个高倍视野(×400),根据标本显色程度判断阳性强度:无色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕黑色为3分;根据阳性细胞占观察细胞的比例分为:阳性细胞数≤10%为1分；11%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。两项分数之和:<2分为阴性(-)；2～3分为弱阳性(+)；4～5分为中度阳性()；6～7分为强阳性()。

1.4数据处理 采用SPSS20.0软件进行t、χ2检验和Spearman等级相关分析法应用于相关性分析。

2 结 果

2.1HER2和TOPOⅡα在结肠癌组和健康对照组1组织中的表达 结肠癌组HER2主要表达于细胞膜，而TOPOⅡα主要见于细胞核。见图1。结肠癌组HER2和TOPOⅡα阳性表达率分别为〔17例(37.8%)〕和〔26例(57.8%)〕；健康对照组1未见HER2和TOPOⅡα表达。 结肠癌组HER2和TOPOⅡα表达阳性率明显高于健康对照组1(P<0.05)。

图1 结肠癌组组织中HER2和TOPOⅡα表达(免疫组织化学染色，×400)

2.2两组HER2和TOPOⅡα血清表达 结肠癌组血清HER2和TOPOⅡα水平均明显高于健康对照组2(P<0.05)，见表1。

表1 两组HER2和TOPOⅡα血清中表达

与结肠癌组比较：1)P<0.05

2.3HER2和TOPOⅡα在癌组织表达相关性 结肠癌组织中26例TOPOⅡα表达阳性中有15例HER2表达阳性；19 例TOPOⅡα表达阴性的结肠癌组织中17例HER2亦表达阴性；HER2和TOPOⅡα表达呈正相关(r=0.480,P<0.05)。

2.4HER2和TOPOⅡα在结肠癌血清中表达相关性 结肠癌组血清中HER2和TOPOⅡα表达正相关(r=0.610,P<0.05)。

3 讨 论

HER2蛋白是原癌基因HER2/neu(17q12-21)〔6〕编码的具有受体酪氨酸激酶活性的185 kD跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体家族的一员。HER2由胞外氨基末端配体结合域、单链跨膜区域及具有酪氨酸激酶活性的细胞内区域构成，存在于细胞表面的胞外段受蛋白酶裂解脱落释放进入血液即血清HER2(sp185)蛋白。本研究结果提示：HER2参与了结肠癌的发生，且在组织和血清中均高表达。HER2主要表达于胚胎时期，成年后一般只出现在少数正常组织中。当HER2表达上调，可被相应的配体激活影响下游信号转导途径，如通过蛋白激酶(Akt)通路抑制细胞凋亡，促进肿瘤细胞存活；通过Ras/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径影响肿瘤细胞的增殖、分化〔7〕。故出现扩增和过表达，可能提示肿瘤的发生〔8〕。

TopoⅡα是真核细胞内的一种重要核酶，是DNA拓扑异构酶的一种〔9〕。因其能够催化DNA链的断裂与结合，调控DNA的拓扑状态，参与基因的复制、转录、翻译等过程中DNA 空间结构和生理功能调节，故与细胞增殖和凋亡密切相关。本研究结果提示，TopoⅡα可能参与了结肠癌的发生，且在组织和血清中均高表达。TopoⅡα通过催化切断DNA链的磷酸二酯键，产生DNA缺口而发挥作用，这种缺口可以改变DNA分子的拓扑结构，从而解决DNA缠结状态这一问题。TopoⅡα表达降低，将阻止DNA快速修复，断裂的DNA双链积累将激活DNA损伤反应，导致G1、S和(或)G2阻滞，诱导细胞凋亡〔10〕。研究显示TopoⅡα多表达于增殖细胞内，而且在快速增殖细胞中的表达水平是静止细胞的数倍，主要表达于S 期、G2期及 M 期细胞，高表达时提示肿瘤复制加快,增加肿瘤的恶性程度〔6〕。故TopoⅡα过表达可能提示肿瘤的发生〔11〕。

本研究显示，HER2和TopoⅡα在结肠癌组织和血清中表达呈正相关。由于HER2基因与TopoⅡα基因均定位于17q12～q21染色体上，所以两种基因的扩增或缺失可能具有协同效应。当HER2表达增高，可激活PI3K和Ras/MAPK等信号通路，调节下游靶基因，间接促进TopoⅡα表达上调，这在分子水平上为二者在结肠癌中表达相关性提供了一定的理论依据。血清检测是一个非侵入性并可量化的检测方式，利于早期筛查，故联合检测二者在结肠癌组织和血清中的表达，为了解HER2和TopoⅡα与结肠癌发生发展关系提供了一定的实验基础〔12〕。为确保HER2和TOPOⅡα作为结肠癌诊断标志物的可靠性，还需要进行更多样本的研究，以确立二者对结肠癌的诊断价值。