miR-194-5p靶向MEX3A调控肝癌细胞活性和凋亡的机制

刘占伟 祖恩霞 潘跃银 石明宏

(1安徽医科大学附属省立临床学院肿瘤内科，安徽 淮南 230001；2安徽理工大学附属肿瘤医院肿瘤内科；3安徽医科大学附属省立医院肿瘤内科；4安徽理工大学附属肿瘤医院肿瘤放疗科)

微小RNA(miRNA)是由19～23 nt组成的短链非编码RNA小分子，与人类多种疾病的发生有关〔1〕。目前发现，30%～90 %的人类基因是由miRNA调控的，其调控网络十分复杂〔2〕。miR-194-5p在很多癌症中均有报道〔3〕，但其在肝癌中的报道甚少。MEX3A属于人类 MEX3家族的一员，与MEX3B、MEX3C、MEX3D是同源基因，该家族基因具有高度保守的KH结构域，该结构域可结合RNA和ssRNA，参与蛋白的DNA转录及mRNA翻译〔4，5〕。有研究报道，MEX3A在膀胱癌、胃癌中表达〔6，7〕，但其在肝癌中的表达尚未见报道。本研究以肝癌细胞HepG2为研究对象，检测HepG2细胞中miR-194-5p、MEX3A的表达，观察过表达miR-194-5p、敲减MEX3A、过表达MEX3A对HepG2细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞HepG2、正常肝细胞L02均购自美国菌种保藏中心(ATCC)；DMEM培养基、胎牛血清、噻唑蓝(MTT)试剂、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、电化学发光(ECL)发光液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将HepG2、L02细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640/DMEM培养基，置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度约75%，用胰蛋白酶消化1 min，按照1∶3的比例更换培养基，每2 d传代1次。

1.2.2细胞转染 将miR-194-5p mimics、miR-NC、si-MEX3A、si-con、miR-194-5p+pcDNA-MEX3A、miR-194-5p+pcDNA按照脂质体LipofectamineTM2000说明书操作步骤转染至HepG2细胞，分别标记为miR-194-5p 组、miR-NC组、si-MEX3A组、si-con组、miR-194-5p+pcDNA-MEX3A组、miR-194-5p+pcDNA组，转染后培养48 h，用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.2.3qRT-PCR实验 取适量对数生长期1.2.2各组细胞，遵照RNA抽提试剂盒说明书要求提取RNA，进行定量，然后按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书检测miR-194-5p、MEX3A。采用2-△△Ct计算miR-194-5p、MEX3A的表达。

1.2.4Western印迹实验 收集1.2.2各组细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min。取上清置于EP管，加入5倍SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加发光液，曝光。

1.2.5MTT实验 取适量1.2.2各组细胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培养4 h，然后弃去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡，使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的活力与细胞的OD值呈正比。

1.2.6Annexin V-FITC/PI流式细胞术实验 用结合缓冲液 500 μl 悬浮1.2.2各转染组细胞，分别加入5 μl的 Annexin V-/FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。采用流式细胞仪分析测定结果。细胞的凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。每个样品重复3次。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测实验 构建WT-MEX3A(含MEX3A 3'UTR片段)和MUT-MEX3A(含MEX3A 3'UTR片段突变体)的荧光素酶报告载体，采用LipofectamineTM2000分别将WT-MEX3A和MUT-MEX3A与miR-194-5p mimics、miR-NC共转染，分别标记为miR-194-5p 组、miR-NC组,转染后培养24 h，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒技术手册操作，记录萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶激发值，以两者的比值评价MEX3A基因的激活程度。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。

2 结 果

2.1miR-194-5p和MEX3A在肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L02中的表达 与L02组相比，HepG2组细胞中miR-194-5p表达显著降低，MEX3A mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 MEX3A蛋白表达

2.2过表达miR-194-5p对肝癌HepG2细胞增殖的影响 与miR-NC组相比，miR-194-5p组HepG2细胞中miR-194-5p表达显著升高，48、72 h时细胞活性显著降低(P<0.05)。见表2。

表1 miR-194-5p和MEX3A在肝癌HepG2细胞和正常肝细胞L02中的表达

表2 过表达miR-194-5p对肝癌HepG2细胞增殖的影响

2.3过表达miR-194-5p对肝癌HepG2细胞凋亡的影响 与miR-NC组〔(6.79±0.71)%〕相比，miR-194-5p组HepG2细胞凋亡率〔(18.34±1.22)%〕显著升高(t=14.172,P=0.000)。

2.4抑制MEX3A表达对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响 与si-NC组相比，si-MEX3A组HepG2细胞中MEX3A表达显著降低(图2)，48、72 h时细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见表3。

图2 MEX3A蛋白表达

表3 抑制MEX3A表达对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响

2.5miR-194-5p靶向调控MEX3A的表达 运用miRcode数据库预测到miR-194-5p与MEX3A 3'UTR存在结合位点(图3)。双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组(1.01±0.09)相比，miR-194-5p组WT-MEX3A细胞中荧光活性(0.39±0.04)显著降低(t=10.904,P=0.000)，MUT-MEX3A细胞中荧光活性不受影响(miR-NC组：0.97±0.08，miR-194-5p组：0.99±0.07；t=0.326，P=0.761)。与miR-NC组(0.51±0.05)相比，miR-194-5p组细胞中MEX3A表达(0.19±0.03)显著降低；与anti-miR-NC组(0.48±0.04)相比，anti-miR-194-5p组细胞中MEX3A表达(0.82±0.07)显著升高，均具有统计学意义(P<0.05)。见图4。

2.6MEX3A过表达逆转了过表达miR-194-5p对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用 与miR-NC组相比，miR-194-5p组HepG2细胞中MEX3A表达显著降低；48、72 h时细胞活性显著降低，细胞凋亡率显著升高；与miR-194-5p+pcDNA组相比，miR-194-5p+pcDNA-MEX3A组HepG2细胞中MEX3A表达显著升高，48、72 h时细胞活性显著升高，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图5，表4。

图3 MEX3A的3’UTR中含有与miR-194-5p互补的核苷酸序列

1～4分别为：miR-NC组，miR-194-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-194-5p组图4 各组MEX3A蛋白表达

1～4分别为：miR-NC组，miR-194-5p组，miR-194-5p+pcDNA组，miR-194-5p+pcDNA-MEX3A图5 MEX3A蛋白表达

表4 MEX3A过表达逆转了过表达miR-194-5p对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用

与miR-NC组比较：1)P<0.05；与miR-194-5p+pcDNA组比较：2)P<0.05

3 讨 论

miRNA在癌症中的调控作用已得到普遍认可〔6〕。同一个miRNA在不同癌症中可能发挥不同的作用，同一个miRNA在同一个组织中的不同生长期(胚胎期、成熟期)或癌症和疾病的不同阶段的表达也是不同的〔7,8〕，但miR-194-5p在肝癌中的研究甚少。卓丽娟等〔9〕通过miRNA芯片检测肝癌细胞中的差异表达miRNA中发现，miR-194的表达出现异常升高。Kong等〔10〕研究报道，miR-194-5p在肝癌组织和细胞系中的表达均出现异常降低，并且通过CCK8法和克隆形成实验及Transwell实验验证过表达miR-194-5p可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究运用qRT-PCR、Western印迹检测了HepG2细胞中miR-194-5p的表达，结果与Kong等〔10〕的结果一致，但与卓丽娟等〔9〕的发现相悖。这为miR-194-5p的功能研究提供了参考，也为肝癌中miR-194-5p的研究提供了理论依据。进一步研究，通过MTT法和流式细胞术检测了HepG2细胞的活性和凋亡，发现过表达miR-194-5p可抑制HepG2细胞的活性并促进细胞凋亡，提示miR-194-5p在肝癌中的潜在治疗作用。通过生物信息学预测发现，miR-194-5p与MEX3A存在互补的结合位点，又运用双荧光素酶报告基因检测实验验证了miR-194-5p靶向MEX3A，且miR-194-5p可负向调控MEX3A的表达。

最新研究发现，MEX3A和MEX3B同为细胞质处理小体(P小体)的重要组成部分，主要参与mRNA的降解或抑制〔11,12〕。外国学者报道，MEX3可能通过泛素化参与了mRNA的调控〔13〕。MEX3A参与机体多种疾病的进展，包括癌症，但其在肝癌中的作用研究很少。Jiang等〔14〕在胃癌的研究中发现，敲除MEX3A可抑制胃癌细胞的集落形成、迁移和侵袭，并在体内可抑制肿瘤的生长，MEX3A在癌组织和胃癌细胞中的表达均出现明显的升高。Pereira等〔15〕、Krepischi等〔16〕的研究均提示MEX3A为致癌基因，但并未继续深入研究其对癌细胞表型的影响。房超等〔17～19〕的系列研究显示，下调MEX3A在膀胱癌中的表达可抑制膀胱癌细胞增殖，促进膀胱癌细胞凋亡，发挥抑制膀胱癌细胞进一步恶化的治疗作用。本研究检测了肝癌细胞HepG2中MEX3A的表达，结果显示，MEX3A在HepG2细胞中的表达明显高于正常肝细胞L02中的表达，这是国内外首次发现MEX3A在肝癌细胞中的表达。但本研究的不足之处在于未在肝癌组织中检测MEX3A的表达，不能更充分地证明MEX3A在肝癌中的作用。这也为后续研究MEX3A在肝癌中的潜在治疗价值提供了理论依据。进一步研究发现，敲减MEX3A可抑制HepG2细胞的增殖并促进其凋亡，这预示着抑制MEX3A可在肝癌中发挥治疗作用。过表达MEX3A具有与敲减MEX3A相反的作用，甚至可以逆转过表达miR-194-5p对HepG2细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，这部分结果在一定程度上可验证miR-194-5p与MEX3A之间的靶向调节关系，更重要的是，为miR-194-5p、MEX3A在肝癌中的作用机制研究及临床治疗价值探讨奠定实验基础。

综上所述，miR-194-5p可抑制肝癌细胞的增殖，促进凋亡，其机制可能与靶向MEX3A有关，为肝癌精准治疗的研究及应用提供参考。