多囊卵巢综合征患者血清和卵泡液中Adropin水平对胚胎发育质量的影响

奚 迪，郑英霞，刘 斌，匡乐乐，任懿倩，高玉平△

(上海交通大学医学院附属新华医院：1.生殖医学中心；2.检验科,上海 200092)

夫妇同居且有正常性生活，未避孕1年以上未受孕称为不孕症[1]。《中国不孕不育现状调研报告》指出，我国不孕不育症患者高达15%～20%，且有年轻化趋势[2]。

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄女性最常见的妇科内分泌疾病，根据鹿特丹标准[3]，我国育龄妇女患病率为5.6%[4]。PCOS以稀发或无排卵、高雄激素血症、卵巢多囊样变为特征[5]，严重影响了女性的生育能力。而寻求辅助生殖技术(ART)助孕的PCOS患者通常临床结局较差，易发生卵子成熟障碍、受精障碍等问题。

2008年KUMAR等[6]发现由能量稳态相关基因(Enho)编码的分泌性蛋白Adropin，但其详细作用机制及机体代谢途径尚未明确[7]。在以往的研究中，Adropin已被发现在与PCOS相关疾病如代谢综合征[8-9]、糖尿病[10]、子宫内膜癌[11]及心血管疾病[12-13]中具有临床应用价值，推测它在PCOS相关的不孕症中也具有研究前景。

本研究旨在分析PCOS患者的血清和卵泡液中Adropin的表达水平与各临床指标的关系，及对体外受精(IVF)胚胎质量的预测价值，为临床早期预计PCOS患者ART结局提供实验依据和参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究纳入2017年9月至2018年8月在本院生殖医学中心首次进行IVF助孕的患者共60例。受试者均签署知情同意书。

PCOS组纳入标准主要参照2003年鹿特丹标准[5]，同时参考PCOS中国诊疗指南：患者必须有月经稀发或无排卵或不规则子宫出血。另外再符合高雄激素血症(临床性和生化性)或卵巢多囊样病变中的1项，同时逐一排除可能引起高雄激素的疾病和引起排卵异常的疾病。排除标准：(1)库欣综合征；(2)非经典型先天性肾上腺皮质增生(NCCAH)；(3)卵巢或肾上腺分泌雄激素的肿瘤；(4)功能性下丘脑性闭经；(5)甲状腺疾病；(6)高泌乳素血症；(7)早发性卵巢功能不全(POI)。

对照组纳入标准：因输卵管因素进行IVF助孕、月经周期和排卵有规律的不孕症患者；年龄匹配、促排方案与PCOS组一致，同时排除PCOS及其他可能引起高雄激素的疾病和引起排卵异常的疾病。

所有患者需同时排除：(1)男方重度少精、弱精、畸形精子症等男性因素不育；(2)重度子宫内膜异位症；(3)既往卵巢病变史或卵巢手术；(4)生殖系统恶性肿瘤；(5)遗传病家族史；(6)体外受精-胚胎移植(IVF-ET)禁忌证。

1.2研究方法

1.2.1促排卵方案 所有患者采用拮抗剂方案进行促排卵。自患者月经第3天，B超卵巢处于基础状态，开始每天肌肉注射促性腺激素(Gn)：重组人促卵泡素 r-FSH(普利康600 IU/支，MSD)。根据患者体质量肌肉注射150～250 IU/d，用药5 d后，根据卵巢的反应[B超监测卵泡大小及血清促黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)及孕酮(P)水平]调整Gn剂量，当优势卵泡≥14 mm或LH≥10 IU/L时加用拮抗剂(思则凯0.25 mg/支，MerckSerono) 0.25 mg/d至人绒毛促性腺激素(HCG)日(包括 HCG日)。

1.2.2触发方案 当至少1个卵泡直径≥18 mm或2个卵泡直径≥17 mm，结合血清E2、LH和P水平决定停用促性腺激素。若患者中重度卵巢过度刺激征(OHSS)的发生风险不高，给予肌肉注射HCG 5 000～10 000 U，具体剂量根据HCG日的卵泡数量决定。肌肉注射HCG 35～36 h后在阴道B超引导下取卵，卵母细胞在体外培养4～6 h后进行常规体外受精或单精子胞浆内注射。取卵当日给予黄体支持，肌肉注射黄体酮针剂 80 mg/d。

1.2.3标本采集 分别在患者促排卵周期的月经第3天、HCG日以及取卵日早晨8点肘静脉采血3.0 mL，1 000×g离心15 min后取血清标本，分装后于-80 ℃保存待测；取卵日通过B超下细针穿刺术穿刺患者第一个优势卵泡，获得无稀释、未被血液污染的第一管卵泡液，经实验室捡卵后充分混匀，1 000×g离心15 min后取上清液，分装后于-80 ℃保存待测。

1.3仪器与试剂 采用全自动微粒子化学发光仪及配套试剂(贝克曼库尔特，美国)运用酶化学发光法检测血清E2、LH、卵泡生成素(FSH)、P、催乳素(PRL)、睾酮(T)和胰岛素(INS)水平；采用全自动生化分析仪及配套试剂(日立，日本)运用己糖激酶法检测血清葡萄糖(Glu)水平；采用全自动化学发光免疫分析仪及其配套试剂(西门子，德国)检测血清促甲状腺激素(TSH)水平；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(华美生物，中国武汉)检测血清及卵泡液Adropin水平(赛默飞世尔酶标仪，美国)。

1.4方法 按仪器及试剂说明书操作。使用人Adropin(ENHO)酶联免疫试剂盒检测Adropin水平：用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，于包被ENHO抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的ENHO抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样本中的ENHO呈正相关性。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(A值)，计算样本水平。

2 结 果

2.1PCOS患者的Adropin水平及临床参数 PCOS组患者基础LH值、空腹INS水平、HCG日E2值明显高于对照组，HCG日FSH值、血清和卵泡液中的Adropin水平明显低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 PCOS患者的Adropin水平及临床参数

2.2取卵日PCOS患者Adropin水平 血清中Adropin水平明显高于卵泡液中水平，差异有统计学意义。PCOS患者中Adropin水平显明低于对照组中水平，差异有统计学意义。见图1。

注：Ser为血清，Fol-F为卵泡液,Con为对照组。其中*表示P<0.001

图1取卵日PCOS患者血清及卵泡液中Adropin水平

2.3PCOS患者IVF胚胎培养结果 PCOS组的获卵数、正常受精数、正常卵裂数、优质胚胎数和可移植胚胎数显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.01)；PCOS组卵子利用率低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；但优质胚胎率和正常受精率两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 PCOS患者IVF胚胎培养结果

注：卵子利用率=可移植胚胎数/获卵数×100%；正常受精率=(D1出现2PN及2PB卵子数)/IVF加精卵子总数或卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)注射MⅡ卵子总数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂数×100%[14]。

2.4PCOS患者Adropin水平与临床参数及胚胎质量的相关性分析 血清和卵泡液中Adropin水平与BMI、基础LH值、LH/FSH值、空腹胰岛素、获卵数呈负相关性(P<0.05)，但与基础E2值、基础及HCG日FSH值呈正相关性(P<0.05)；此外，血清Adropin水平与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、HCG日E2值、多PN受精率呈负相关性(P<0.05)，但与正常受精率呈正相关性(P<0.05)。见表3。

表3 PCOS患者Adropin水平与临床参数及胚胎质量的相关性分析(ng/mL)

续表3 PCOS患者Adropin水平与临床参数及胚胎质量的相关性分析(ng/mL)

注：HOMA-IR=Glu×INS/22.5；卵子利用率=可移植胚胎数/获卵数×100%；正常受精率=(D1出现2PN及2PB卵子数)/IVF加精卵子总数或ICSI注射MⅡ卵子总数×100%；优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂数×100%[14]

3 讨 论

Adropin参与人体能量代谢、调节脂类的生成、维持体内葡萄糖的平衡并增加胰岛素的灵敏度，但其机制仍不十分明确[15]，在预测辅助生殖治疗结局中的作用也尚无定论。PCOS是育龄女性常见的妇科内分泌疾病，是引起无排卵性不孕症的主要原因，本研究的主要目的是探讨血清和卵泡液中的Adropin水平对PCOS患者在辅助生殖治疗中胚胎发育的预测价值。

PCOS患者的促排卵方案调节了Gn使用剂量，但由于PCOS患者窦卵泡数较多，最终获卵数也显著高于对照组，该基数的增多提高了PCOS组正常受精数、正常卵裂数、优质胚胎数和可移植胚胎数。本研究显示PCOS患者的卵子利用率低于对照组，这与PCOS患者体内的高LH水平和低FSH水平有关，过量分泌的LH与低于正常量的FSH易造成卵泡闭锁并过早黄体化，导致卵泡发育不良和排卵障碍，卵母细胞的成熟度下降直接对卵子利用率产生不良影响，卵子利用率低下会降低胚胎的正常受精、优质胚胎和囊胚形成的比例，在获卵数相近的情况下，PCOS患者每周期最终获得可用胚胎的数量减少，同时也减少了移植和妊娠的机会。

在本研究中，两组患者卵泡液中Adropin的表达均低于血清水平，与BOUSMPOULA等[16]的研究结果一致。Adropin主要合成于人类肝脏、脑组织等一些外周组织，又经血清-卵泡屏障过滤，导致卵泡液中Adropin浓度较低。与对照组相比，PCOS患者血清和卵泡液Adropin水平显著降低，与部分研究结果一致[16-18]。PCOS患者存在肥胖、葡萄糖耐量受损、胰岛素抵抗等代谢紊乱现象，Adropin通过激活葡萄糖氧化的限速酶-丙酮酸脱氢酶，能够提高细胞膜的葡萄糖转运蛋白4的表达，同时下调对丙酮酸脱氢酶有抑制作用的丙酮酸脱氢酶激酶4，促进胰岛素诱导PI3K/PKB的磷酸化，从而提高机体对胰岛素的敏感度，降低IR导致的卵泡发育停滞、月经稀发或闭经的情况，提高患者的生育力。本研究显示Adropin水平与HOMA-IR的呈负相关性，提示Adropin对PCOS患者卵母细胞的发育潜能具有正面的作用，推测高Adropin水平可能改善胚胎质量与不孕症治疗效果。

血清Adropin水平与BMI的相关性目前存在争议，本研究显示PCOS患者血清和卵泡液Adropin水平与BMI呈负相关性，与其他报道结果一致[10,19]，另有一些研究者发现两者呈正相关性[16,20]或无相关性[21]。

本研究另一结果表明，血清Adropin水平与PCOS患者正常受精率呈正相关性，与多PN受精率呈负相关性。多PN受精又称为多精受精，其原因主要是受精时有两个或两个以上的精子穿入卵子，体外授精后16～20 h可观察到受精卵含有大于或等于3个原核(多见3PN)，是异常受精的类型之一。多PN的受精卵普遍不能正常发育，胚胎易早期死亡，通常弃去不用于移植。有研究证实，PCOS患者的ART不良结局在胚胎培养方面表现为受精率下降[22]，主要原因与卵母细胞质量低下及胚胎发育潜能不足有关。如果胚胎受精率异常，应首先分析卵子成熟度是否有异常。Adropin作为能量调节因子，参与PCOS病情的发生发展，低Adropin表达加重患者的能量代谢紊乱，从而引起的卵母细胞抗氧化应激能力低下和线粒体功能障碍，影响了卵母细胞成熟所需的细胞质的储备、受精中卵母细胞的激活和胚胎的早期正常发育。ICSI注射前通过剥除颗粒细胞可以直接观察到卵子的第一极体的排出情况(MⅡ率)，作为评估卵子成熟度的指标之一，用于预测ICSI正常受精率[23]。但IVF无法提前预知MⅡ率，大大降低了预测IVF正常受精率的效果。而PCOS患者血清Adropin水平的降低，提示了IVF方式下，患者的正常受精率可能下降，多PN受精率可能增高，导致可利用胚胎数减少，ART结局差。另有研究者报道，ICSI周期的3PN率为5.0%，远低于IVF周期的33.9%[24]。因此，对于低Adropin水平的不孕症患者，胚胎实验室可以改变授精方式，实行ICSI受精，以确保正常受精卵母细胞的比例，最大限度实现对卵母细胞的利用。

鉴于本研究的患者仅限于首次行IVF治疗的患者且数据数量有限，后期还需进一步扩大样本量，并增加PCOS患者治疗前后Adropin水平变化及相应的IVF结局情况，以进一步证实此结论。此外，今后还应当对患者的移植妊娠结局及新生儿情况进行随访，以进一步分析研究Adropin对IVF-ET结局的预测价值。

4 结 论

血清Adropin水平与PCOS患者的卵母细胞发育及受精情况存在一定相关性，对预测患者胚胎质量、选择授精方式具有参考意义，提示胚胎实验室进行早期干预以提高患者可用胚胎的数量与质量。