MicroRNA在非酒精性脂肪性肝病发病过程中作用的研究进展

何占娣，刘迎娣

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）包括单纯性脂肪肝（simple fatty liver, SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化[1-2]。NAFLD的患病率呈逐年上升趋势，NAFLD患者占全球总人口的25%～45%[1-2]，在肥胖症、糖尿病或代谢综合征人群中，NAFLD的患病率高达70%～90%[1-2]。目前，该病已成为严重威胁人类健康的常见疾病之一。有报道称 NAFLD相关的肝硬化仍无有效的治疗措施，肝移植是其最终选择[1]。故探究NAFLD的发病机制并寻找有效的治疗潜在靶点成为研究者们关注的焦点。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一种小的非编码RNA，大小约为20～25个核苷酸，与信使RNA（messenger RNA, mRNA）靶向结合后形成RNA诱导的沉默复合体，进而抑制mRNA翻译或促进其降解，在转录后水平调控基因表达[3]。miRNA参与了人体内几乎所有的生理和病理过程，包括细胞的分化和增殖、信号转导、炎症和免疫反应、物质代谢、病毒宿主相互作用以及肿瘤的发生[3]。miRNA可能是某些疾病发生、发展过程中的重要节点，也可能是诊断这些疾病的潜在标志物以及治疗的潜在靶点[3]。在过去的20年中，miRNA在肝脏炎症、纤维化和硬化中扮演的角色已经被广泛描述[4]。本文就miRNA在NAFLD中的异常表达情况、致病作用、潜在的临床应用以及有待解决的问题作一综述。

1 miRNA参与NAFLD的发病过程

与健康对照者相比，NAFLD患者体内多种miRNA的表达出现异常（上调或下调），详见表1。当miRNA表达上调或下调时，其对靶点蛋白合成的抑制作用增强或减弱，导致靶点蛋白的合成减少或增加，若靶点蛋白恰好又参与肝脏脂肪代谢和转运，则会引起肝脏脂肪代谢和转运障碍，进而导致NAFLD的发生。

2 miRNA在NAFLD发病机制中的作用

在NAFLD的发病机制中，SFL向NASH、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化发展的潜在机制均未完全阐明。传统的“二次打击”学说已获得广泛认可。“第一次打击”主要是肥胖症、糖尿病、代谢综合征等伴随的胰岛素抵抗，导致肝细胞内脂肪过量沉积；“第二次打击”是脂肪过量沉积的肝细胞发生氧化应激，导致线粒体功能障碍，炎症介质产生和释放，肝星状细胞激活，进而引起肝细胞损伤、肝脏炎症和纤维化[29]。近年来，随着与NAFLD的发病机制密切相关的因素越来越多地被发现，“二次打击”学说已被“多次打击”学说所取代[29]。“多次打击”包括胰岛素抵抗、脂肪组织功能障碍、线粒体功能障碍、内质网应激、饮食因素、铁超载、肠道微生态失衡、慢性炎症状态以及遗传学和表观遗传学因素。在表观遗传学因素中，又以对miRNA的研究最为深入。以下是在NAFLD发生、发展过程中发挥重要作用的相关miRNA的总结。

表1 NAFLD中表达异常的miRNATable 1 Abnormal expression of miRNA in NAFLD

2.1 miRNA-34a 研究发现NAFLD小鼠模型和NAFLD患者的肝组织和血清中miRNA-34a表达均上调（见表1）。miRNA-34a的主要靶点蛋白是Sirtuin 1（SIRT1），SIRT1通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptors α, PPARα）和肝脏X受体（liver X receptor, LXR），或者抑制PPARγ的共激活物1a、甾醇调节元件结合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP1c）和法尼醇X受体（farnesoid X receptor, FXR）等转录因子维持脂代谢平衡。NAFLD患者miRNA-34a表达上调导致SIRT1合成减少[31]，而抑制miRNA-34a表达则能恢复SIRT1的合成，从而激活腺苷一磷酸激活的蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK）和PPARα，促进脂肪的分解代谢。

2.2 miRNA-122 miRNA-122是肝脏中最丰富的miRNA，在肝脏生理和脂肪代谢中发挥重要作用[32]。miRNA-122可与人体内多种重要的脂肪代谢酶相互作用，比如乙酰辅酶A羧化酶2（acetyl co-enzyme A carboxylase 2, ACC2）和 SREBP[33]。与健康对照者相比，NAFLD患者肝组织miRNA-122表达下调[9]，血清miRNA-122表达上调[9]。尽管结果相反，但miRNA-122与NAFLD发病机制的关系已得到确切的证实。研究发现抑制NAFLD小鼠模型miRNA-122表达可以减轻肝脏脂肪变性，降低血浆胆固醇水平，这与降低肝脏甾醇和脂肪酸合成速率以及激活AMPK介导的脂肪分解代谢有关[34]。此外，体外细胞实验还证实miRNA-122通过靶向脯氨酸4-羟化酶亚基α1调节肝星状细胞增殖及胶原蛋白合成[35]，进而引起肝纤维化的发生、发展。

2.3 miRNA-155 在NAFLD患者中，促进脂肪合成的因子如CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα）、C/EBPβ、PPARγ和LXRα[36]，促进纤维化的因子如血小板衍生生长因子、SMAD3和C/EBPβ[37]，抑制肿瘤的因子如细胞因子信号抑制因子1均可引起miRNA-155表达异常[38]。在NAFLD动物模型中，则呈现出相互矛盾的结果。例如，高脂饮食饲喂miRNA-155表达缺陷小鼠模型出现肝脏脂肪变性加重[38]，而蛋氨酸-胆碱缺乏饮食饲喂miRNA-155基因敲除小鼠模型则出现肝脏脂肪变性减轻，而且不伴有肝脏损伤或炎症[37]。这些结果提示，miRNA-155在肝病患者中可能发挥不同的作用[37]。

3 miRNA在NAFLD诊断中的作用

如表1所示，与健康对照者相比，NAFLD患者血清或肝组织的多种miRNA表达异常（上调或下调）。此外，不同阶段的NAFLD患者（包括SFL、NASH、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化），血清或肝组织miRNA的表达水平也是不同的。因此，这些表达异常的miRNA可以作为NAFLD诊断和分期的潜在生物标志物。

3.1 miRNA-34a 多项研究表明，与健康对照者相比，NAFLD患者血清和肝组织miRNA-34a表达上调[33]。此外，不同阶段的NAFLD患者，血清miRNA-34a表达水平也不同，miRNA-34a表达水平与血清转氨酶水平、肝脏脂肪变性程度、炎症活动度分级和纤维化分期均呈现正相关[33]。

3.2 miRNA-122 与miRNA-34a相似，miRNA-122也被证明有可作为NAFLD诊断和分期生物标志物的潜力。与健康对照者相比，NAFLD患者血清miRNA-122水平升高[33]，远早于血清转氨酶水平升高的时间[39]。此外，miRNA-122作为生物标志物也可以扩展应用到NAFLD的分期中[9]。

3.3 miRNA-192 NAFLD小鼠模型血清miRNA-192水平与NAFLD特征性病理改变的严重程度呈现正相关[40]。另外，与健康对照者相比，NAFLD患者血清miRNA-192表达上调已被证实[9]。此外，还有研究表明，血清miRNA-122和miRNA-192的水平呈现高度正相关[9]。

3.4 miRNA组合 除对单个miRNA的检测，对多个miRNA的联合检测（包含miRNA-122-5p、miRNA-1290、miRNA-27b-3p和 miRNA-192-5p）在NAFLD诊断方面显示出更高的准确性[12]。此外，另一联合检测（包含miRNA-122、miRNA-192、miRNA-19a、miRNA-19b、miRNA-125b和miRNA-375）也有较高的准确性[9]。

4 miRNA在NAFLD治疗中的作用

如前所述，miRNA在NAFLD发生、发展的不同阶段（从SFL到NASH、脂肪性肝纤维化和脂肪性肝硬化）均发挥重要作用，因此也成为NAFLD治疗的潜在靶点[41]。基于miRNA的治疗方案已经在NAFLD动物模型中广泛开展，疗效确切的方案甚至已经进入到临床试验阶段。

4.1 miRNA-34a miRNA-34a的拮抗剂circRNA_0046366能够抑制miRNA-34a的活性，使PPARα信号通路恢复正常，应用于NAFLD小鼠模型后，肝脏脂肪变性获得改善[42]。而另一项将miRNA-34的模拟物（MRX34）用于原发性肝癌治疗的Ⅰ期临床试验（ClinicalTrials.gov注册号：NCT01829971）却由于严重的免疫相关不良事件而提前终止[43]。

4.2 miRNA-103和miRNA-107 在肥胖小鼠模型中，miRNA-103和miRNA-107表达上调，应用miRNA-103/miRNA-107的拮抗剂，能够使靶点蛋白caveolin1（胰岛素受体的关键介质）的合成恢复正常，减轻胰岛素抵抗[19]。但是，另有两项正在进行的临床试验（ClinicalTrials.gov注册号：NCT02826525和NCT02612662）显示，Regulus公司开发的治疗NAFLD和2型糖尿病的miRNA-103/miRNA-107拮抗剂（RG-125/AZD4076）疗效并不令人满意[43]。

4.3 miRNA-122 miRNA-122也是NAFLD治疗的潜在靶点。miRNA-122在肝组织中高度表达，在肝脏的发育、分化过程中扮演重要角色[44]。过表达miRNA-122可以抑制YY1-FXR-SHP调节轴，减少肝内甘油三酯的合成[44]。但是，miRNA-122也是HCV复制的重要因子，过表达miRNA-122治疗脂肪肝的同时，也促进了HCV的复制[45]。

5 尚待解决的问题

随着研究的不断拓展，NAFLD中表达异常的miRNA越来越多地被发现，其影响人体脂肪代谢和转运的机制越来越清楚，基于miRNA的诊断试剂和治疗药物正在开发当中。但是，miRNA代表了一种基因表达调控的新方法，与其他新方法类似，在临床应用之前，首先要解决该方法本身存在的一些问题。

5.1 miRNA下游的靶点不具有惟一性 miRNA下游的靶点不是惟一的，单个miRNA可以调控几十个甚至数百个基因表达[4]。调节某个miRNA的表达会影响下游多个靶点蛋白的合成，这些靶点蛋白的生物学效应可能是相互抵消的，最终显示不出疗效[43]。即使这些效应没有相互抵消，其中一些效应确实是我们需要的，但另一些效应也可能是对机体有害的。

5.2 miRNA对下游靶点的调节具有相互性 在疾病的发病过程中，miRNA与靶点之间经常存在相互调节的现象，我们称之为“反馈环”。例如，miRNA-17-5p可以靶向翻译PPARα的mRNA，抑制其合成。反过来，PPARα可以结合miRNA-17-5p的启动子，促进其表达。通过人工干预过表达miRNA-17-5p，虽然能使PPARα合成减少，但反过来也会使自身的表达下调[46]。

5.3 miRNA药物不具器官/细胞靶向性 动物模型研究表明静脉注射miRNA模拟物/抑制剂是一种有价值的疗法。但是，这些小分子药物进入机体后，并不会靶向特定的器官/细胞，在修复靶器官/细胞功能的同时，也会对正常的器官/细胞造成损伤。此外，这些小分子药物如果未经适当的修饰，进入机体后会引起强烈的免疫反应，造成广泛的免疫损伤[43]。

5.4 miRNA药物的理化性状具有不稳定性 miRNA的模拟物/抑制剂均为小分子物质，大小约为20～25个核苷酸，需要在超低温环境中才能保持正常的理化性状和生物学功能。脱离了超低温环境后，其理化性状是不稳定的，很容易在短时间内降解，失去生物学功能。如何提高miRNA药物稳定性，使其能够在常规条件下长期储存，是有待解决的一大难题[43]。

6 小 结

近年来，有大量的研究关注了miRNA在不同阶段NAFLD中发挥的作用。这些研究包括应用微阵列芯片技术的基因表达数据，应用下一代测序技术的动物模型和人体标本数据，以及应用原位杂交和传感器技术的细胞表型数据。基于这些研究，本文综述了miRNA在NAFLD中的表达异常、致病作用、潜在的临床应用以及尚待解决的问题。miRNA在NAFLD发病机制中的作用已经得到了充分的证实，因此，其作为NAFLD诊断的生物标志物或治疗的潜在靶点是有根据的。由于miRNA表达异常只是NAFLD等慢性多因素疾病的致病因素之一，因此，大多数miRNA的调节作用也是有限的。实际上，多数miRNA仅在疾病的发病过程中扮演着“精密调谐器”的角色。此外，它们也缺乏器官/细胞特异性。尽管如此，许多研究人员相信，只要不断提高对它们在相关疾病中所扮演角色的认知，miRNA终将会给这些疾病的治疗带来新的希望。