基于“成分-靶点-通路”的鹿茸网络药理学研究△

吕经纬，李晶峰，边学峰，张楠茜，张辉，孙佳明

长春中医药大学/吉林省人参科学研究院，吉林 长春 130117

鹿茸CerviCornuPantotrichum为鹿科动物梅花鹿CervusnipponTemminck或马鹿CervuselaphusLinnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。其性温，味甘、咸，归肝、肾经，首载于《神农本草经》，列为中品[2]，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒[1]的功能。鹿茸是目前发现的唯一能够完全再生的哺乳动物器官[3]，研究发现，鹿茸中含有蛋白质、氨基酸、多糖、多肽、脂类、矿物质、激素、多胺、生长因子等成分[4-5]，是古今中外通用的名贵中药材。现代药理学研究表明，鹿茸具有壮肾阳、促智并改善记忆障碍、抗抑郁、抗衰老、抗疲劳、抗肝损伤、保护心肌、调节血糖、提高免疫功能、抗肿瘤及性激素样作用等多种药理活性[6]。

虽然有关鹿茸化学成分、药理机制及临床应用的研究不断涌现[7-9]，但均未系统、整体地分析鹿茸中成分、靶点、通路和疾病的相互关系。网络药理学、整合药理学等概念的相继提出，以及分子生物学、生物信息学、计算机技术的不断发展，为阐明中医药科学内涵提供了新的思路与方法，其整合生物信息学、分子生物学及各大数据库信息，系统地研究“成分-靶点-通路-疾病”之间相互作用，探究中医药“多组分、多靶点、多通路”的药理机制，与中医药整体观、辨证论治、组方配伍、协同增效等原则不谋而合[10]。本研究利用网络药理学的技术方法，探索鹿茸主要物质基础、关键靶点、疾病之间的相互作用关系，为进一步阐明鹿茸药理机制提供新的方法与思路。

1 材料与方法

1.1 鹿茸成分与靶点挖掘

利用中药分子机制生物信息学分析平台BATMAN-TCM(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)挖掘鹿茸的化学成分，并利用该服务器的“成分-靶点相似性”原理，设置阀值“Score cutoff=30”，计算化学成分对应的潜在靶点，最后利用Cytoscape网络图形处理软件构建“化学成分-潜在靶点”网络。BATMAN-TCM收录了包括TCMID数据库中的46 914个方剂、8159种中药及25 210个中药化合物，该平台的靶点预测功能是基于Perlman等[11]的SITAR理念(Similarity-based Inference of drug-TARgets)，利用药物靶点相似性原理来预测已知中药化合物的潜在靶点，具有速度快、准确度较高的特点。

1.2 蛋白互作网络构建与关键靶点筛选

为了明确鹿茸靶点群中的“关键靶点”，利用STRING平台(https：//string-db.org/)构建靶点群蛋白互作网络(protein protein interaction network，PPI network)，设置物种为“Homo sapiens”(智人)进行操作，最低相互作用阀值设为中等“medium confidence=0.4”，并用Cytoscape软件的“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑属性分析，计算网络整体的“节点度值分布(Node Degree Distribution)、介数中心性(Betweenness Centrality)”2个重要拓扑参数，以Degree和Betweenness的均数为“卡值”，选取Degree和Betweenness同时在卡值之上的靶点为“关键靶点”，研究关键靶点可能的药理作用。Degree反映了网络节点与其他节点的连接数目，Betweenness是网络中所有最短路径中经过该节点的路径数目与最短路径总数之比，Degree与Betweenness是衡量一个节点在网络中重要性的两个主要拓扑参数，也是判断一个靶蛋白是否为“关键靶点”的重要依据[12]。

1.3 GO生物过程富集

关键靶点的GO生物过程注释利用Cytoscape软件中的“ClueGO”插件对鹿茸的关键靶点进行GO(gene ontology)生物过程富集，建立GO生物过程层级关系图，分析关键靶点在体内可能的生物过程。

1.4 KEGG信号通路分析

信号通路分析利用Metascape数据库(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)将鹿茸关键靶点进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)信号通路富集，物种与背景设置均为“Homo sapiens”(智人)进行操作，研究关键靶点投射的KEGG信号通路与疾病之间的相互关系，明确鹿茸可能的药理机制。

1.5 网络图构建和分析

Cytoscape 3.6.1构建鹿茸“成分-关键靶点-通路”网络图，利用Network Analyzer插件计算Degree值，网络拓扑学分析成分、关键靶点及信号通路相互之间的关系，研究鹿茸可能针对潜在靶点和信号通路的治疗作用及其发挥药效的主要机制。

2 结果

2.1 鹿茸成分与潜在靶点

在BATMAN-TCM服务器共挖掘到鹿茸成分14个(见表1)，对应的潜在靶点306个。如图1所示，14个正方形节点为鹿茸中的成分，306个六边形节点代表鹿茸的潜在靶点，363条边代表靶点和化学成分之间的相互作用，充分体现了鹿茸多成分、多靶点的特点。

2.2 蛋白互作与关键靶点分析

为研究各潜在靶点在体内的相互作用关系，寻找关键靶点，将潜在靶点蛋白群进行PPI网络分析(见图2)，结果共发现212个靶蛋白可以发生相互作用，产生488条代表蛋白之间相互作用的边，其中度值、介数越大颜色越深，说明蛋白相互作用越强。PPI网络平均度值为4.60，平均介数为3.56×10-2，度值、介数超过平均值的靶蛋白共有26个(见表2)，说明这26个靶点在PPI网络中处于关键位置，可能是鹿茸实现药理效应的关键靶点。

2.3 GO生物过程富集

按照P值(校正)<0.01的标准，利用ClueGO插件对26个关键靶点进行GO生物过程富集研究。结果26个关键靶点可以参与体内57个GO生物过程(见图3)，包括G蛋白耦合受体蛋白信号通路的负调节、一氧化氮生物合成、前列腺发育、钠离子输送的调节等方面调控。

表1 鹿茸筛选后得到的14个成分

注： 表示鹿茸成分； 表示潜在靶点。图1 鹿茸14个活性成分-306个靶蛋白网络图

注： 颜色由浅到深代表度值、介数从小到大。图2 鹿茸靶蛋白PPI网络图

序号靶点中文名称靶基因Uniprot IDDegreeBetweenness1Thyroid receptor-interacting protein 2甲状腺受体相互作用蛋白2MED1Q15648220.230 2 2Adenylate cyclase type 1腺苷酸环化酶1型ADCY1Q08828180.071 4 3Retinoic acid receptor RXR-alpha 视黄醇受体RXR-αRXRAP19793160.111 8 4C-X-C chemokine receptor type 4CXC趋化因子受体4型CXCR4P61073140.060 2 5Estrogen receptor雌激素受体ESR1P03372130.174 5 6D(2)dopamine receptorD(2)多巴胺受体DRD2P14416130.070 3 7Mu-type opioid receptorMu型阿片受体OPRM1P35372130.058 5 8RAC-alpha serine/threonine-protein kinaseRAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT1P31749110.376 4 9Retinoic acid receptor RXR-gamma视黄醇受体RXR-γRXRGP48443110.238 5 10Cytosolic purine 5′-nucleotidase细胞溶质嘌呤5′-核苷酸酶NT5C2P49902110.091 4 11Sodium channel subunit beta-2钠通道亚基β-2SCN2BO60939100.059 9 12Sodium channel subunit beta-1钠通道亚基β-1SCN1BQ0769990.057 4 13Sodium channel subunit beta-3钠通道亚基β-3SCN3BQ9NY7290.057 4 14Retinoic acid receptor alpha维甲酸受体αRARAP1027690.228 1 15Catenin beta-1连环蛋白β-1CTNNB1P3522280.088 3 16Mothers against decapentaplegic homolog 3母亲反对decapentaplegic同系物3SMAD3P8402280.049 0 17Beta-adrenergic receptor kinase 1β-肾上腺素能受体激酶1ADRBK1P2509880.374 1 18cGMP-inhibited 3′,5′-cyclic phosphodiesterase BcGMP抑制3′,5′-环磷酸二酯酶BPDE3BQ1337070.209 5 19Growth factor receptor-bound protein 2生长因子受体结合蛋白2GRB2P6299360.041 7 20Lecithin retinol acyltransferase卵磷脂视黄醇酰基转移酶LRATO9523760.036 4

续表2

注： 表示病毒对宿主形态或生理的调节； 表示G蛋白偶联受体蛋白信号通路负调节； 表示一氧化氮生物合成过程； 表示前列腺发育； 表示环化酶活性的调节； 表示分支结构形态发生的调节； 表示钠离子转运的调节。图3 鹿茸57个GO生物过程

2.4 KEGG信号通路分析

将26个关键靶点进行KEGG信号通路富集研究，结果按照lgP值共筛选出7大类68条信号通路，如图4、表3所示，包括雌激素信号通路、乳腺癌、子宫内膜癌等特定类型癌症通路，缝隙连接、Rap1信号等免疫系统通路，趋化因子等信号转导通路，白细胞跨内皮迁移、Wnt信号等抗肿瘤通路以及物质依赖性、内分泌系统等通路。

2.5 生物通路分析

通过Cytoscape 3.6.1构建“成分-关键靶点-通路”网络图(见图5)，包含108个节点(14个成分、26个关键靶点和68条生物信号通路)和285条边，其四边形代表鹿茸成分，圆形代表关键靶点，三角形代表信号通路，线代表成分、关键靶点和信号通路之间的关系。其度值较大的成分有三磷酸腺苷、视黄醇、17-β-雌二醇，度值分别为10、6、3，其分别与10个、6个、3个关键靶点相关。其度值较大的靶点有AKT1、GRB2、PRKCA，度值分别为51、34、33，其分别与51条、34条、33条信号通路相关。其度值较大的信号通路有癌症信号通路、甲状腺激素信号通路、癌蛋白多糖信号通路，度值分别为10、7、6，其分别与10个、7个、6个关键靶点相关。

注： 颜色越深代表富集到该通路的基因数越多。图4 鹿茸7条主要KEGG信号通路富集图

3 讨论

通过对鹿茸“成分-关键靶点-通路”网络进行分析，发现鹿茸14个成分分别调控26个关键靶点，Clue GO分析得到7个子簇57个GO生物过程及7大类68条KEGG信号通路，呈现出鹿茸多成分、多靶点、多通路整合调节作用的网络特点。其中，鹿茸成分三磷酸腺苷、视黄醇和氨基葡萄糖分别通过ADCY1、AKT1、CTNNB1、GRB2、SMAD3、PRKCA、RARA、RXRA、RXRG、CXCR4 10个关键靶点直接作用于癌症信号通路(表3，1)。将网络分析结果与文献报道进行相互印证可见，三磷酸腺苷具有较强的抗人食管癌细胞增殖作用[13]，视黄醇代谢相关基因LRAT和RDH12对宫颈鳞癌细胞具有抑制效果[14]，氨基葡萄糖具有抗肿瘤和免疫增强作用[15]。PI3K/Akt信号通路(表3，37)是癌症信号通路(表3，1)中重要途径，是调控肿瘤发生的重要通路之一[16]。

表3 鹿茸7大类68条KEGG信号通路及相关靶基因

续表3

续表3

注： 表示鹿茸成分； 表示潜在靶点； 表示潜在通路。图5 鹿茸成分-关键靶点-通路网络图

徐婷婷[17]报道特异性诱导视黄醇X受体RXRA形成RXRA-LBD四聚体可阻止PI3K/AKT信号通路激活从而抑制癌细胞增殖。网络分析结果显示视黄醇可直接作用于视黄醇X受体RXRA，推测鹿茸可能通过作用于此靶点从而影响癌症信号通路发挥药效。从图5分析推测三磷酸腺苷、视黄醇和氨基葡萄糖是鹿茸潜在的抗肿瘤成分，并通过癌症通路、PI3K/AKT等信号通路发挥抗肿瘤作用。此外，邹三鹏等[18]研究发现17-β-雌二醇能够有效抑制MHCC97H肝癌细胞的侵袭；曹容华等[19]研究表明接种肿瘤后同时注射前列腺素E1 7 d对肿瘤有抑制作用。网络分析结果显示鹿茸中17-β-雌二醇、前列腺素E1能够作用到ESR1、Med1、PRKCA关键靶点，推测鹿茸可能通过作用于这些靶点从而影响癌蛋白多糖等信号通路发挥药效。结合文献报道以及网络分析结果，表明鹿茸在治疗肿瘤疾病方面具有潜在的优势。

卢贺等[20]发现鹿茸调节cAMP/cGMP信号通路(表3，59)归经于肾脏、肝脏发挥治疗骨关节炎的作用，并可以激活Smad3蛋白(表2，16)，调控软骨细胞增殖和分化促进关节软骨的修复，从而对骨关节炎大鼠起到治疗作用[21]。石晓征等[22]发现梅花鹿茸Ⅰ型胶原可激活Wnt信号通路(表3，68)，显著提高骨质疏松大鼠的骨密度。李文凯等[23]研究表明三磷酸腺苷可通过促进骨髓间充质干细胞成骨转化治疗骨质疏松。网络分析结果显示三磷酸腺苷可通过AKT1蛋白直接作用于骨细胞分化信号通路(表3，32)；同时，17-β-雌二醇也能够通过AKT1靶点直接作用于骨细胞分化信号通路，表明鹿茸可能通过作用于此靶点影响骨细胞分化信号通路发挥药效，推测鹿茸在抗骨关节炎、治疗骨质疏松症方面具有潜在的优势。

网络药理学挖掘鹿茸中含有17-β-雌二醇、雌酮等雌激素，长期服用外源性雌激素是乳腺癌发生的高危因素之一[24]。有研究证实短期(小于5年)、单纯雌激素制剂的药物应用不增加乳腺癌的风险，而长期(超过10年)、雌孕激素联合用药等情况将增加乳腺癌的风险[25-27]，由此可见乳腺癌危险的增加取决于雌激素的剂量和治疗时间。鹿茸中雌激素主要包括雌二醇、雌酮，其中梅花鹿茸中雌二醇、雌酮质量分数分别为0.103、0.289 μg·g-1，马鹿茸中雌二醇、雌酮质量分数分别为0.090、0.434 μg·g-1[28]，其雌激素含量较低，且鹿茸作为中药长期服用的情况也很少见。但值得注意的是，对于有乳腺癌病史的患者，还应充分评估患者风险，准确掌握鹿茸用药指征。

本文从网络药理学角度探讨并揭示了鹿茸的主要成分、作用靶点、相关生物信号通路。网络分析推测鹿茸除了在抗骨关节炎、治疗骨质疏松症的作用之外，在抗肿瘤方面具有潜在的优势。本文为进一步研究鹿茸的作用机制提供理论参考，为鹿茸的进一步开发应用提供科学依据。