九香虫及相似品的多糖组成分析△

李莎，宋淑敏，晏仁义，马晓晶，陈科力，黄璐琦，，李娟，*

1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065；2.天津益倍生物科技集团有限公司，天津 300457；3.中国中医科学院 博士后科研流动站/中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700

九香虫AspongopuschinensisDallas为蝽科兜蝽属昆虫[1]，是重要的药用昆虫和保健食品[2]。作为中药，其具有理气止痛、温中助阳的功效[3]。现代研究表明，九香虫有抗菌、抗癌、止癌痛、促血管生成等药理作用，临床多用于治癌痛、下焦虚寒病症、小儿厌食症、阳痿等[4]。九香虫作为保健食品，在我国食品养生方面有着悠久的历史，多在四川、贵州和云南等地入锅炒食使用，民间将九香虫泡酒用作壮阳之品[3-6]。研究表明，九香虫富含蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素以及多种微量元素等[7]。

目前市场上对九香虫需求日益增大，其价格也居高不下，九香虫误用、混用现象增多，严重影响质量问题严重。进一步探索九香虫多糖组成，并且与市场上常见的混淆品小皱蝽、黑兜虫、无刺蝽、荔蝽多糖组成进行比较，本研究采用柱前衍生化HPLC对九香虫及其相似品多糖组分进行分析。

1 材料

1.1 仪器

DZF-6020真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)；DZTW电子调温电热套[邦西仪器科技(上海)有限公司]；DK-8D电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；LC-2030C 3D高效液相色谱仪[岛津制作所(日本)]；Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，安捷伦科技公司)。

1.2 试药

无水乙醇(5 L)购自上海沃凯生物技术有限公司；D-甘露糖(25 g)、D-木糖(25 g)、D-阿拉伯糖(25 g)、L-鼠李糖(25 g)、D-半乳糖醛酸(25 g)、D-半乳糖(25 g)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(100 g)购自上海麦克林生化科技有限公司；D-葡萄糖(500 g)购自天津市风船化学试剂科技有限公司；岩藻糖(20 mg)购自成都瑞芬思生物科技有限公司，硫酸(500 mL)、盐酸(500 mL)购自北京化工厂；氢氧化钠(500 g)、三氯甲烷(500 mL)购自天津市康科德科技有限公司；乙腈(4 L)购自上海星可高纯溶剂有限公司。

九香虫及其相似品经湖北中医药大学陈科力教授鉴定，具体信息见表1。

表1 九香虫及其相似品样本信息

2 方法

2.1 多糖的提取

称取10.00 g样品，按料液比1∶30加入300 mL水，加热回流提取1 h，提取两次，合并上清液，减压浓缩至25 mL，加入4倍体积的乙醇(终浓度为80%)醇沉，4 ℃静置过夜，离心取沉淀，置于真空干燥箱内烘干，得粗多糖。

2.2 多糖含量测定

按苯酚-硫酸法测定多糖的含量[9]。

2.3 糖的衍生化

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖对照品适量，置于5 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，配置成质量浓度为1 mg·mL-1混合对照品溶液。吸取混合对照品100 μL，按照样品衍生化步骤进行衍生化。

2.3.2 供试液制备 1)酸水解组：分别称取上述干燥后的多糖适量，配置成质量浓度为10 mg·mL-1的水溶液。吸取上述配置后的溶液各100 μL于试管中，加入70 μL 2.5 mol·L-1硫酸，110 ℃烘箱中水解2 h，取出冷却后，用70 μL 5 mol·L-1NaOH溶液中和，得水解液。2)未酸水解组：样本直接溶解后衍生化。

2.3.3 样品衍生化 向上述水解液或未酸水解的溶液中加入200 μL PMP甲醇溶液0.5 mol·L-1和100 μL NaoH溶液(0.3 mol·L-1)，并旋涡混合，70 ℃水浴反应60 min，冷却，再用100 μL 0.3 mol·L-1HCl中和。再向其中加入1 mL水，2 mL三氯甲烷萃取3次，取水相，过膜。

2.4 单糖组成分析

色谱柱：Inertsil ODS-3(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：5 μL；检测波长：250 nm；流动相：乙腈(A)，水900 mL、乙腈100 mL、0.45 g kH2PO4、0.5 mL TEA pH 7.5(B)；梯度洗脱(0～4 min，6%A；4～5 min，6%～12%A；5～40 min，12%A；40～40.01 min，12%～6%A；40.01～48 min，6%A)。

2.5 主成分分析

使用SIMCA-P软件对单糖组成进行主成分分析(PCA)。采用主成分分析法，通过观察各样品的聚集情况，直观地表达九香虫及其相似品的多糖组成差异。

3 结果

3.1 多糖含量

按2.1项下方法对九香虫及其相似品(小皱蝽、荔蝽、黑兜虫、无刺蝽)进行多糖提取，提取率平均值分别为：(7.92±3.31)%、(8.60±2.72)%、(7.44±1.84)%、(7.97±1.18)%、(8.36±1.67)%。数据显示，九香虫及其相似品的多糖提取率相差不大，得率接近8%，其中小皱蝽相对最多，荔蝽相对最少。采用苯酚-硫酸法测得多糖质量分数平均值：九香虫为(5.23±3.68)%，小皱蝽为(17.64±5.73)%，荔蝽为(6.02±0.45)%，黑兜虫为(7.05±3.50)%，无刺蝽为(10.56±3.26)%。数据显示，九香虫及其相似品的多糖含量差异较大，其中小皱蝽的多糖含量明显较多。

3.2 单糖组成比较

按照2.3.2项下方法对九香虫及其相似品进行酸水解，再对水解产物、非水解产物和单糖对照品分别进行柱前衍生化，再按照2.4项下方法利用HPLC对PMP衍生化的单糖对照品和多糖水解物和未水解物进行色谱分析。混合标准单糖PMP衍生物的HPLC分析结果见图1，九香虫及其相似品未水解组PMP衍生物的HPLC见图2，多糖的水解单糖PMP衍生物的HPLC分析结果见图3，使用SIMCA-P软件对单糖组成进行PCA结果见图4。九香虫及其相似品的单糖组成及其单糖含量(峰面积)结果见表2。

由图2可知，所有类型的样本未酸水解图一致，15 min后没有杂峰，表明水提醇沉已去除游离单糖。由图3可知，九香虫及其相似品的样本中，以甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主，且普遍葡萄糖含量高。

图1 混合标准单糖PMP衍生物的HPLC图

注：1.九香虫；2.小皱蝽；3.荔蝽；4.无刺蝽；5.黑兜虫。图2 九香虫及其相似品未水解组PMP衍生物的HPLC图

注：1.九香虫；2.小皱蝽；3.荔蝽；4.无刺蝽；5.黑兜虫。图3 九香虫及其相似品多糖水解物PMP衍生物的HPLC图

表2 九香虫及其相似品的单糖组成及其单糖含量(峰面积)

注：—表示未检测到此处有相对应的峰及峰面积。

其中九香虫多糖中均含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等单糖，但单糖组成比例差异较大，部分样品甘露糖含量大于葡萄糖含量，而其余九香虫多糖主要是由葡萄糖构成。小皱蝽多糖主要是由葡萄糖构成，并且其含量较大。无刺蝽多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖构成，此外还有少量的鼠李糖，除个别样本中葡萄糖含量较低外，其余无刺蝽多糖中甘露糖、葡萄糖和半乳糖的组成比例相似。荔蝽和黑兜虫多糖主要也是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成，且单糖组成比例差异不大。

由表2可知，在甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例上，九香虫及其相似品同品种各样品之间较为接近，但个别样本稍有差异，主要由于药材炮制、加工和贮藏等因素的影响。按其比例知，九香虫、荔蝽的甘露糖、葡萄糖、半乳糖的含量差异不大，而小皱蝽、黑兜虫的葡萄糖部分明显高于其他两种单糖含量，无刺蝽葡萄糖含量也高于其他两种单糖含量。

注：图中数字代表批次号。图4 九香虫及其相似品不同批次样品单糖组成主成分分析图

从主成分分析结果看出，九香虫、小皱蝽、无刺蝽、荔蝽、黑兜虫，除个别离群值，各品种样本基本分布在不同区域，说明九香虫及其相似品的多糖组成存在明显差异。其中小皱蝽、无刺蝽、荔蝽几个品种不同批次的样本分布比较集中，说明这几个品种多糖组成组内均一性比较好，即多糖组成接近；而九香虫和黑兜虫不同批次的样本分布比较离散，说明这两个品种的多糖组成组内差异较大。

4 讨论

多糖以及聚合糖是有机体不可缺少的主要成分，如研究最多、最广泛的甲壳素，是构成昆虫以及其他动物外壳的主要物质。逯春玲等[8]对土鳖虫、九香虫、僵蚕3种昆虫类药材总多糖含量比较，认为多糖可以作为质量控制指标；冯颖等[10]对云南常见的5种食用蝽象的营养成分分析结果表明，平均总糖质量分数为2.61%。九香虫及类似品的多糖含量存在一定差异，整体规律是：油脂含量高的样品多糖含量相对较低；小皱蝽的多糖含量相对偏高，其次为无刺蝽。小皱蝽的多糖主要由葡萄糖组成，与其他品种的多糖组成差异较大；除小皱蝽外，其他品种多糖组成相似，主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成；虽然不同药材多糖中的单糖组成比例存在一定的差距，但是除个别样品外，均为葡萄糖含量最高。

从主成分分析来看，九香虫的聚合度不高，这与笔者检测的九香虫DNA条形码的结果相似，不能聚合为一类，原因可能为九香虫中存在隐存生物多样性。课题组前期对九香虫类药材进行了系统的性状和显微鉴定[11]，发现黑兜虫与九香虫极相似，本实验中九香虫和黑兜虫不同批次的样本分布比较离散，组内差异较大，单糖组成不能作为区别九香虫和黑兜虫的依据。而小皱蝽与无刺蝽与九香虫区别明显，可作为品种鉴别的依据。本实验通过检测九香虫类药材多糖中单糖组成，为九香虫类药材的品种鉴定和品质评价提供一定的依据。