不同产地梅花鹿鹿茸矿物质元素含量测定与道地性分析△

赵海平，张国坤，姚梦杰，李春义，2*

1.中国农业科学院 特产研究所/吉林省特种经济动物分子生物学省部共建重点实验室，吉林 长春 130112；2.长春科技学院，吉林 长春 130022

鹿茸是梅花鹿CervusnipportTemminck或马鹿CervuselaphusLinnaeus雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，作为珍贵的中药材，也用来作为保健品的原料，具强筋健骨、壮肾阳、益精血等作用[2]，其多种药用和保健功能得到了广泛认可。《中华人民共和国药典》将鹿茸的功能与主治叙述为：壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒。我国市场上的鹿茸药材约有80%产于梅花鹿[3]。梅花鹿鹿茸的道地产区一直是一个悬而未决的问题。梅花鹿养殖主要集中在东北地区[4]，因此业内人士一般认为，东三省是梅花鹿鹿茸的最佳产区。

道地性是药材在特定环境中形成的综合性特征，每种道地药材都具其独特的生态地理环境[5]，因此探索不同产地药材所含成分的差异成为建立药材道地产区检测方法的有效手段之一，如结合相关的有机成分与微量元素来研究药材的道地性[6]。

鹿茸中含有丰富的有机物质、矿物质和微量元素[7-14]。研究证明，不同产地鹿茸中次黄嘌呤[15]、蛋白多肽[16]、核苷类[17]等有机成分均有一定的差异。然而，目前尚未见关于不同产地鹿茸所含矿物质元素的对比研究。本研究采集了梅花鹿鹿茸主产区吉林省和非主产区山东省共7个地区鹿茸为研究对象，采用微波消解法处理样品，运用微波消解-电感耦合等离子质谱(ICP-MS)分析技术随机测定了鹿茸中18种矿物质元素的含量，以期为研究不同产区鹿茸的道地性提供参考。

1 仪器与试剂

密闭微波消解仪(型号：MARS5，美国CEM公司)；电感耦合等离子体质谱(ICP-MS，型号：7700X，美国安捷伦公司)；电热鼓风干燥箱(型号：DHG-9013A，上海一恒仪器有限公司)；冻干机(型号：FDU-1100，东京理化公司EYELA系列)。

元素标准溶液包含Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au(中国计量科学研究院国家标准物质研究中心，质量浓度为100 μg·mL-1)；浓硝酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；30%过氧化氢(南京化学试剂股份有限公司)。

2016年7—8月在吉林省和山东省大型梅花鹿养殖场采取鹿茸42份，详见表1；采样方式：自二杠茸或三杈茸基部锯取厚度为1 cm的鹿茸片。经由依托于中国农业科学院特产研究所的吉林省鹿茸工程技术研究中心鉴定为梅花鹿CervusnipponTemminck鹿茸。

表1 吉林省和山东省鹿茸样品来源信息

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

标准溶液：元素(Na、Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au)标准溶液的原始质量浓度为100 μg·mL-1，使用前稀释至所需浓度。

标准曲线制作：配制Na、Mg、P、K、Ca混合标准曲线质量浓度为0、2、4、6、8、10 mg·L-1。Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au、Cd、Ag混合标准曲线质量浓度为0、5、10、20、50、100 μg·L-1。内标溶液选取一定体积的元素母液，用2%硝酸将其稀释至10 μg·L-1。在选定的浓度范围内做标准曲线，r均大于0.999 0，见表2，表明上述元素在0.3～100 μg·L-1线性关系良好。

表2 元素线性方程

2.2 鹿茸样品预处理

准确称取制备好的鹿茸样品0.5 g于消解罐中，加入4.0 mL浓硝酸、1.0 mL 30%过氧化氢，混匀，盖好内外盖，置于微波消解系统内消解，消解条件见表3。消解完毕后冷却至室温，取出消解罐，将样品转移至50 mL容量瓶中定容，摇匀后待测。ICP-MS仪器工作条件：雾化室温度2 ℃，等离子流14 L·min-1，蠕动泵速度25 r·min-1，等离子射频功率1550 W，辅助气体积流量0.79 L·min-1，雾化器体积流量1.0 L·min-1，KED测定模式。根据仪器灵敏信号进行对不同元素的同位素筛选之后，确定该检测方法中各元素的质量数，见表4。

表3 微波消解条件

2.3 方法学考察

2.3.1 检测限 连续测定空白溶液11次，以测定元素信号响应值的标准偏差的3倍所对应的浓度为检测限，结果见表2，各元素的检测限多处于10-12级别，方法灵敏度高。

2.3.2 精密度试验 取18种元素的标准溶液各自连续进样6次测定含量，18种元素的RSD为1.90%～2.70%，见表2，表明仪器的精密性良好。

2.3.3 重复性试验 随机取鹿茸样品CC1 号6份，按2.2项方法制成待测溶液。测试研究涉及到的18种元素的RSD为1.80%～4.52%，说明方法的重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取鹿茸样品CC1号，按2.2项方法制成待测溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24 h上样，18种元素的RSD为1.21%～4.02%，表明样品在24 h内是稳定的。

2.3.5 加样回收率试验 称取已经测定的样品CC1 0.5 g(5份)，精密称量，精准加入一定量的各元素的对照品溶液，按照相同条件测试，计算各元素的回收率为96.90%～102.80%，RSD均在5%以下。

3 结果

3.1 不同产地鹿茸中18种矿物质元素含量及产地之间差异性分析

采用2.1和2.2描述的方法检测不同产地42份样品元素含量，结果见表5。从地区角度分析，Cr在各个地区鹿茸样品中含量差异无统计学意义，其他元素差异有统计学意义(P<0.01)，如：Co含量四平地区的极显著低于长春和吉林地区，Cd含量四平、长春和吉林3个地区差异有统计学意义。从省份角度分析，山东省4个产区鹿茸P和Ca含量高于吉林省3个产地，且差异有统计学意义(P<0.01)；元素Mg和Zn含量吉林地区鹿茸极显著低于山东地区鹿茸；除临沂样品外，鹿茸元素K含量在吉林产区极显著高于山东其他3个产区。Au在各个产地的大部分样品中均未检出。矿物质元素Ca和P在鹿茸中含量丰富，Ca和P含量比例接近2∶1。

表4 重复性、稳定性及加样回收率试验结果(n=6)

注：Na、Mg、Al、P、K、Ca含量单位是mg·kg-1；Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Se、Cr、As、Cd、Ag、Pb、Ba、Au、Cd、Ag含量单位是μg·kg-1，下同；—表示无数据。

表5 不同产地鹿茸中18种矿物质元素含量

注：上标相同字母或者不标字母表示差异无统计学意义(P>0.05)，不同小写字母表示差异有统计学意义(P<0.01)。

3.2 相关性分析

相关性分析被广泛应用到中药材元素含量及其他营养成分分析中，通过对多个具备相关性的指标进行分析，从而衡量不同组分之间的联系。本研究对鹿茸样品中18种元素进行相关性分析。结果见表6。从表6可以看出，某些元素成分之间存在显著或者极显著相关性。Na与Mg、P、K、Ca、Mn、Cu、Zn、Se、Pb、Ba含量差异有统计学意义(P<0.01)；Mg与P、K、Ca、Cu、Zn、Se、Ba含量极显著相关；P与K、Ca、Fe、Cu、Zn、Se，Cd、Ba含量极显著相关；K和Ca、Cu，Zn、Se、Pb、Ba含量极显著相关；Ca与Fe、Cu、Zn、Se、Cd、Ba含量极显著相关；Mn与Zn、Pb、Ba含量极显著相关；Fe与Co、Cu、Cr、As、Cd含量极显著相关；Co与Cr、As含量极显著相关；Cu与Se、As、Cd含量极显著相关；Zn含量与Pb、Ba含量极显著相关。

3.3 主成分分析

通过SPSS软件对所有样品进行主成分分析，明确18种元素在吉林省和山东省不同产地鹿茸矿物质元素变异中各自的贡献率，结果见表7。从表7可以看出，前2个主成分累计贡献率达到91.88%，能够阐明要说明的大多数变异信息。其中，第1个主成分(PC1)累计贡献率为70.32%，主要反映的是来自Na、P、K、Ca、Mn、Fe、Co、Cu、Zn、Se、As、Cd、Ag、Pb、Ba的信息。第2主成分(PC2)累积贡献率为21.56%，主要反映的是来自Mg、Cr、Ag、Ba的信息。

表6 鹿茸中18种矿物质元素皮尔逊相关性分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

表7 主成分载荷表

4 讨论

东三省的气候条件适合于梅花鹿的养殖，也是我国鹿茸的主要供应区，最有可能成为梅花鹿的道地产区。吉林省是我国梅花鹿茸产量最大的省份[18]。山东省虽然不是我国梅花鹿茸的主产区，但也是除东三省外产量最大的省份之一。本研究首次对梅花鹿茸主产区和非主产区的矿物质元素的含量进行比较分析，为研究鹿茸的道地性提供了理论和数据支持。

道地性是评价中药品质优劣的传统理论和方法，是中医药学经验的科学总结，也是中医理论在长久实践过程中提炼出来的对中药质量控制的客观评价标准[19]，因此道地性作为中医药领域独特的质量评价标准，其理念深深地根植于中医理论体系中[20]。道地药材存在化学成分物质基础特性[21]，具体表现为活性成分的含量差异。矿物元素自身不能合成，必须从环境中摄取，因此不同产地产品有各自的矿物质特征[22-23]。此外，产品的贮藏时间和贮藏条件对其矿物元素含量影响较小[24-25]。因此，相对于有机物，矿物质元素更适合用于研究药材的道地性。虽然不同产地鹿茸中次黄嘌呤[15]、白多肽[16]、核苷类[17]等有机成分均有一定程度的差异，但是上述研究中并没有找到与鹿茸道地性单一相关的因素。

不同产地来源鹿茸矿物质元素差异分析结果表明，有几种元素含量因产地不同而存在差异，如：Co含量四平地区极显著低于长春和吉林地区；Cd含量四平、长春和吉林三个地区差异有统计学意义；山东省4个产区鹿茸P和Ca含量高于吉林省3个产地，且差异有统计学意义(P<0.01)；元素Mg和Zn含量吉林地区鹿茸极显著低于山东地区鹿茸；除临沂样品外，鹿茸元素K含量在吉林产区极显著高于山东其他3个产区等。因此，以某种或某些元素为指标，可以在一定程度上将不同产地的鹿茸进行区分。由于某些种类矿物质元素在鹿茸不同区段含量不同。因此，在通过矿物质元素研究鹿茸道地性时，需要排除鹿茸不同区段矿物质含量的影响。孙伟丽等[26]通过对梅花鹿三杈茸不同加工方式及不同区段20种矿物质元素含量的分析发现，Na、Mg、Al、P、K和Ca在不同区段之间含量差异有统计学意义(P<0.05)，Al、P、Ca、Na、Mg和K含量在煮炸茸和冻干茸两种加工方式之间差异有统计学意义(P<0.05)。本研究所采集的样品来自于鹿茸二杠或三杈的基部，在此部位Zn的含量不存在不同区段和加工方式的差异[26]。主成分分析显示，前2个主成分PC1和PC2的累积贡献率为91.88%，能够解释大部分变异，Zn位于第一类主成分中。因此，Zn含量可以作为单一相关的候选因素，研究鹿茸的道地性。相关分析显示：Zn含量与Pb、Ba含量极显著相关，说明Pb和Ba含量可以作为辅助指标。

重金属元素在人体中蓄积到一定量会引发中毒症状，因为重金属元素往往使蛋白质变性，影响组织细胞的生理功能，进而影响肝脏、肾脏、神经系统等功能。重金属元素一直是衡量中药材品质的关键因素[27]，《中华人民共和国药典》2015年版限定了中药材重金属质量分数为Pb≤5.0 mg·kg-1、Cd≤0.3 mg·kg-1、Cu≤20 mg·kg-1、As≤2.0 mg·kg-1。鹿茸作为动物性来源中药材也可能会因为动物摄入草食饲料、饮水等因素带来重金属超标问题。本研究通过《中华人民共和国药典》2015版的ICP-MS法，测定的7个产地来源的42份鹿茸样本重金属Pb、Cd、Cu和As均无超标，符合我国中药材重金属的安全性规定，因此可以放心食用。