麝香的微型DNA条形码鉴别方法研究△

2019-09-17赵玉洋周骏辉袁媛黄璐琦金艳蒋超

中国现代中药 2019年9期

赵玉洋，周骏辉，袁媛，黄璐琦，金艳，蒋超

中国中医科学院中药资源中心道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700

麝香为麝科动物林麝MoschusberezovskiiFlerov、马麝M.sifanicusPrzewalski(M.c.sifanicusBüchner)或原麝M.moschiferusL.成熟雄体香囊中的干燥分泌物[1-2]。麝香为安宫牛黄丸、片仔癀等中成药的重要药味，具有开窍醒神、活血通经、消肿止痛等功效，临床应用很广，价格昂贵。近年来，麝科动物野生居群快速减小[3-4]，天然麝香已不能满足中药临床药用的需求[5]，麝香药材掺伪、混伪现象不断出现，而麝香药材及其香囊缺乏必要的性状特征，鉴别困难。

DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术[6]。COI片段(Cytochrome c oxidase subunit 1)是最广为接受的动物药材鉴定用DNA条形码片段[7-10]，此外，其他片段如cytochrome b(Cyt b)，12S rRNA线粒体控制区control region(CR)也常用于动物的分类和药材的鉴别研究。已有研究通过提取麝类动物的肌肉组织、毛发等的DNA，使用COI或Cyt b通用引物扩增对麝类动物进行DNA条形码鉴别[5，11-12]。然而，麝香药材中残留的DNA含量很少，降解严重，难以扩出658 bp的全长COI片段，致使DNA条形码分子鉴定法难以用于麝香药材的分子鉴定。微型DNA条形码是从全长序列中设计出新的PCR引物，用于扩增短DNA片段(约100～300 bp)并进行测序的一种方法[13]。源于COI的微型DNA条形码序列可区分90%以上动物物种[14-15]。本文根据麝香及其混伪品COI序列设计出一对微型DNA条形码引物，可从肌肉组织、毛发、香囊及药材中扩出约180 bp的片段并能准确区分麝香及其混伪品。

1 材料

1.1 样品

共采集61批麝香及其混伪品样品(见表1)，其中包括养殖场采集的林麝毛发15份、麝香2份，马麝毛发10份、麝香1份，原麝毛壳4份、麝香5份，麝鼠原动物6份、麝鼠香3份，常见混伪品鸡、牛、羊、猪原动物组织各3份，市售麝香毛壳2份、麝香仁2份。样品采集后置-80 ℃冰箱存于中国中医科学院中药资源中心。

表1 61批麝香及其混伪品样品信息

1.2 试剂

Dneasy血液及组织核酸提取试剂盒(上海凯杰企业管理有限公司，批号：69506)，TIANamp微量DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，批号：DP316]，Wizard基因组DNA提取试剂盒(Promega公司，批号：A2360)，QIAamp粪便DNA提取试剂盒(上海凯杰企业管理有限公司，批号：51504)，SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(批号：RR070A)，2000 bp DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司，批号：BM101)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，批号：02194004)。

1.3 仪器

VeritiTM型PCR扩增仪(美国Applied Biosystem公司)，SYNGENE SYNGENE型凝胶成像系统(GENE公司)；Nanodrop 2000型微量核酸定量分析仪(美国Thermo Scientific公司)。

1.4 序列

从Genbank数据库中下载麝类及其混伪品COI序列或全长线粒体DNA作为参考序列进行系统发育树分析，其中全长线粒体DNA序列Genbank登录号：林麝(GQ329032.1，JX627397.1)，原麝(EU835717.1，JN632662.1)，马麝(KP684123.1，JF700176.1)，安徽麝(M.anhuiensis，NC020017.1，KC013352.1)。

2 方法

2.1 DNA提取

肌肉组织、香囊使用DNeasy组织血液DNA提取试剂盒按说明书进行DNA提取。对毛发样品，取约20根带有毛囊的毛发，剪除毛囊1 cm以上的部分，使用TIANamp微量DNA提取试剂盒(北京天根公司)提取DNA。

麝香仁使用改良CTAB法进行DNA提取：取麝香仁0.2 g置15 mL离心管中，加入60%乙醇10 mL，充分旋涡振荡混匀，65 ℃水浴20 min，6000 g离心30 min，弃尽上层清液；沉淀加入已灭菌的CTAB提取液1000 μL，65 ℃水浴30 min；加入900 μL三氯甲烷-异戊醇抽提2次；转移500 μL上层清液至另一新的2.0 mL的微量离心管中，加入330 μL异丙醇溶液，置-20 ℃放置1 h；12 000 g离心10 min，弃上层清液，加入70%乙醇2次；无水乙醇漂洗1次，12 000 g离心10 min，弃上层清液，挥干乙醇后，加入30 μL灭菌水溶解沉淀，-20 ℃保存。

2.2 引物设计

使用MEGA 6.0软件对麝类及其混伪品物种COI序列及全线粒体基因组序列进行序列比齐。在正品和混伪品DNA差异最大的区域两侧相对保守的位置使用Premier primer 5.0软件设计引物，扩增产物大小为120～200 bp，设计出麝香微型DNA条形码鉴别引物对SX-178.F和SX178.F(见表2)。

2.3 PCR扩增、电泳检测

25 μL PCR反应体系包含10×FBI buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)1.5 μL，上游及下游引物各0.5 μL，SpeedSTAR HSTaqDNA聚合酶(大连宝生物公司)0.2 μL，DNA模板(约10 ng·L-1)1 μL，加灭菌蒸馏水补足至25 μL。引物序列及PCR反应程序见表2。PCR反应结束后，取反应产物，加入6×Loading buffer 5 μL(Takara公司)，混匀后于EtBr染色的2%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

2.4 序列分析

取阳性扩增产物送由睿博兴科生物技术有限公司进行双向测序。使用BioEdit 7.2.6软件对测序峰图进行校对、去除引物序列及拼接，获得对应测序结果。从GenBank获取的麝香及其混伪品物种COI序列及全线粒体基因组序列，与测序序列一起经多重序列比对后利用MEGA 6.0基于Kimura-2-parameter模型计算种内和种间遗传距离，使用Neighbour Joining法构建系统发育树，bootstrap值设定为100次重复。

3 结果

3.1 麝类药材全长COI序列DNA条形码鉴别能力

麝类不同材料DNA提取效率具有明显区别，从肌肉或香囊囊皮中提取的DNA质量浓度为60.2～230.7 ng·μL-1，毛发中则减至16.5～31.4 ng·μL-1。麝香药材DNA提取效率最低，分别使用Wizard基因组DNA提取试剂盒、QIAamp粪便DNA提取试剂盒、DNeasy组织血液DNA提取试剂盒，经典CTAB法及改良CTAB法进行DNA提取，仅改良CTAB法能从麝香中提出DNA，质量浓度为5.5～16.1 ng·μL-1，使用全长COI引物LCO1490和HCO2198进行扩增，肌肉组织、香囊和毛发样品均能扩出约700 bp条带，而在麝香样品中无条带。

除5批毛发样品PCR产物浓度过低，其余样品均成功测序，测序峰图经校对、去除引物区后获得658 bp全长COI序列。将获得的测序结果及GenBank上下载的序列比齐后进行序列分析发现，麝类及其混伪品COI序列包含419个保守位点和239个变异位点，其中158个为4个麝属物种的变异位点。麝属物种序列A、T、C、G碱基平均含量分别为27.4%、30.3%、26.1%、15.9%。各麝种种内和种间遗传距离有较大区别，安徽麝平均种内遗传距离为0，种间遗传距离为0.145 8，安徽麝与林麝遗传距离最近，为0.015。原麝具有最大的种内距离(0.006)，是其他物种的2倍(见表3)。系统发育树结果表明，除安徽麝外其他物种均能聚成相对独立的支(99%支持率)，麝香基原动物原麝、林麝、马麝与混伪品麝鼠、猪、牛、羊、鸡等可相互鉴别(见图1)。

表2 麝香DNA条形码鉴别反应条件

表3 麝香与其混伪品种内、种间遗传距离

图1 麝香及其混伪品的COI NJ系统发育树结果

3.2 麝香微型DNA条形码与全长DNA条形码鉴别能力的比较

COI全长DNA条形码引物无法从麝香样品中扩出条带(见图2，泳道1～3)，而使用微型DNA条形码可从麝香和麝鼠香中扩出约178 bp的条带(见图2)。序列去除引物区后长132 bp，包含111个保守位点和21个变异位点，其中12个变异位点为麝属4个物种的差异位点。麝香微型DNA条形码多态性(10.81%)低于全长DNA条形码(24.01%)。麝属物种微型DNA条形码序列A、T、C、G碱基平均含量分别为31.3%、35.5%、15.2%、18.0%。该微型DNA条形码引物也能从鸡、羊、牛等混伪品中扩出178 bp的条带，且各物种均只有一种单倍型序列，种内遗传距离为0。林麝与马麝、林麝与原麝、马麝与原麝种间遗传距离分别为0.066、0.063、0.029。构建NJ系统发育树各物种均能聚成相对独立的支(99%支持率)，麝香基原动物原麝、林麝、马麝与混伪品麝鼠、猪、牛、羊、鸡等可相互鉴别，其鉴别结果与全长DNA条形码结果一致。

注：M.100 bp DNA ladder；1.林麝毛发；2.马麝毛发；3.原麝肌肉；4～8.原麝香仁；9～10：林麝香仁；11.马麝香仁；12～15.麝鼠香；16.空白对照(dd H2O为模板)；+表示明亮条带；±表示暗条带；-表示无条带。图2 麝香原动物及麝香仁PCR扩增结果

3.3 市售样品的DNA条形码鉴别

所有麝香及麝鼠香样品，包括2批标为“原麝”的毛壳香囊(XN001～002)和2批标为“麝香”的市售样品，用于测试全长DNA条形码和微型DNA条形码的鉴别能力，原麝、林麝、马麝、麝鼠、猪、牛、羊、鸡肌肉组织或毛发样品各3批作为阳性对照同时实验。扩增和测序后使用系统发育树根据聚类结果进行鉴别，结果样品XN001和XN002全长DNA条形码和微型DNA条形码均与鸡聚为一支，表明其物种基原为鸡。麝香样品SX001和SX002只能用微型DNA条形码鉴别，测序和系统发育树结果表明其基原为原麝(见图3)。

4 讨论

麝是亚欧大陆珍稀濒危物种，自1979年开始，所有麝属物种均已列入《濒危野生动植物国际贸易公约》附录进行保护。目前天然麝香产量低，人工养殖规模小，国内外市场麝香供需的巨大缺口导致我国麝资源面临严重危机，存在较为严重的掺伪、混伪现象，需要建立准确的基原鉴别方法。

尽管全长DNA条形码已用于多种动物及其制品的分子鉴定，该方法用于麝香样品鉴定仍存在较大不足。除改良的CTAB法外，其他多种DNA提取方法均无法从麝香样品中回收DNA，且提取的DNA浓度均远低于肌肉组织和毛发样品。改良CTAB法提出的DNA可能来源于麝香香囊囊皮或毛发脱落的微量细胞或组织碎片，其DNA含量很低、严重碎片化，且存在大量PCR抑制物，使用全长DNA条形码扩增引物扩增具有困难。

研究发现，高度降解或DNA含量低微的样本可扩出短PCR产物片段。而100 bp左右的微型DNA条形码也具有与全长DNA条形码相似的物种鉴别能力[14，16-17]。本研究根据麝香及其混伪品COI序列差异，从中设计出短扩增片段的通用引物对，可从原麝、林麝、马麝与混伪品麝鼠、牛、羊、鸡中扩出178 bp的微型DNA条形码条带，该微型DNA条形码片段与Genbank数据库中的COI序列有98%～100%一致性。该结果表明，微型DNA条形码可用于麝香药材的鉴定，该方法也有望推广至猪胆粉、熊胆粉、阿胶等DNA降解或DNA含量低微的材料，解决动物类中药鉴别难题。