《中国药典》收载动物药材DNA条形码鉴定研究策略与方法△

姚辉，张辉，陈士林，3*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中药资源教育部工程研究中心，北京 100193；2.长春中医药大学 中医药与生物工程研发中心，吉林 长春 130117；3.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700

动物药在我国具有悠久的应用历史，早在《神农本草经》中就有记载。历代本草共记载动物药600余种，《中国中药资源志要》收录药用动物414科879属1574种，约占全国中药资源总种数12%，其中脊椎动物占多数，约占药用动物总数的61%。动物药是祖国医药学遗产中的重要组成部分，具有活性成分强、疗效确切等特点，如斑蝥中含有的斑蝥素为抗癌有效成分，临床治疗肝癌和膀胱癌有效，同时还具有升高白细胞的作用；水蛭含有的水蛭素是重要的抗凝血物质，对脑血管疾病、高血脂症等均有显著疗效[1]。大多数动物药材来自野生资源，部分药材的基原动物已被列入《国家重点保护野生动物名录》和《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录，如穿山甲、麝类3种、玳瑁、黑熊、棕熊、梅花鹿、海马属5种等。近年来动物药材的需求量不断上升，但药用动物的养殖规模远没有达到市场需要，市场上混伪品、替代品的不断出现严重影响了动物药材的应用效果和用药安全。动物药材的传统鉴定方法有来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定，在不同种类动物药材的鉴定中发挥着重要的作用。随着分子生物学技术的发展，应用分子生物学手段进行动物药材的鉴定越来越受到关注，《中华人民共和国药典》(《中国药典》)一部收载乌梢蛇和蕲蛇的特异性PCR鉴别方法。

作为一种新兴的生物鉴定方法，DNA条形码技术是应用基因组中一段标准的DNA短序列进行物种鉴定的分子诊断技术，自2003年由加拿大动物学家Paul Hebert提出以来[2-3]，就受到生物分类学家的广泛关注，为因资金不足以及年轻分类学家匮乏而沉寂的生物分类学带来了新的发展机遇[4]。陈士林等[5]首先探讨了DNA条形码技术在中药材鉴定中应用的技术方法、技术路线和关键问题，展望了DNA条形码在中药材鉴定中的应用前景，并指出DNA条形码在中药鉴定中的成功应用将给生药鉴定方法带来革命性突破。与传统鉴定方法相比，DNA条形码鉴定具有客观性强、重复性好和通用性等优点，易于构建统一的DNA条形码序列数据库[6-7]。本文对动物药材DNA条形码鉴定体系的建立、动物药材DNA条形码研究中的关键技术和DNA条形码数据库进行介绍，以期对动物药材DNA条形码研究、珍稀药用动物资源保护和动物药材的市场监管提供参考。

1 以COI为主体、ITS2为补充的动物药材DNA条形码鉴定体系的建立

Hebert等[2]对11个门13 320个同属物种的COI比较分析，提出COI序列可作为DNA条形码序列对动物进行鉴定。在COI序列对动物药材的鉴定方面，张辉等[8]选取《中国药典》中45个动物药材，涉及基原物种51种，分析样品COI序列的种内种间变异情况、barcoding gap、鉴定效率等，考察COI序列鉴定动物药材的有效性和准确性。结果表明，COI序列作为DNA条形码适用于《中国药典》中动物药材的鉴定，为COI条形码准确鉴定《中国药典》中动物药材提供了分子依据。

目前，很多学者应用COI序列对基原动物和动物药材进行了鉴定研究，其中对角甲类和蛇类动物药的研究报道较多。角甲类动物药临床应用历史悠久、其作用常常是植物药和矿物药不能替代的，更是一些经典名方中不可缺少的主药之一。大多数角甲类动物药如鹿角、羚羊角等为骨化的动物样品，其DNA降解比较严重，提取难度较大。Luo等[9]应用DNAout试剂盒提取角甲类样品DNA，对15个种72份角甲类动物药材COI序列进行了分析，PCR扩增与测序效率均为100%，COI序列长度为477 bp，其中156个位点(32.7%)具有多态性。角甲类动物药种内与种间的遗传变异平均值分别为0.4%和15.8%，种内的最大K2P距离均小于种间的最小K2P距离。NJ树分析表明马鹿、梅花鹿、麋鹿、黄麂、羚羊角、山羊角、鳖甲各自聚为一支，野生物种与家养物种能明显分开。进一步对GenBank数据库中53个物种313条COI序列进行了系统分析，BLAST1分析表明其物种鉴定成功率为100%。该研究为濒危物种贸易监管提供了有力的技术支持，帮助限制野生动物资源的过度利用和非法的贸易流通。Yan等[10]采用相似的方法，对角甲类动物药材10个物种47份样本进行了COI序列分析研究。张蓉等[11]和崔丽娜等[12]应用COI条形码序列分别对鹿茸及其混伪品进行研究，均表明COI可鉴定鹿茸及其混伪品。刘冬等[13]对鹿茸、鹿角、鹿鞭、鹿筋、鹿尾、鹿胎分别进行DNA提取、COI序列扩增和测定，构建鹿类药材8个物种101份样品COI序列数据库，对市售40份鹿类药材进行鉴定，发现其中18份为《中国药典》规定物种，22份不是《中国药典》规定物种。刘旭朝等[14]应用COI序列对62份市售水牛角样品研究，发现34份市售水牛角药材基原动物为水牛，占54.8%；18份为牦牛，3份为山羊，另有2份样品无法获得COI序列，5份样品无法鉴定到基原物种，已被卵菌、子囊菌、甲虫、蛾等外源物污染。张龙霏等[15]利用COI检验中药制剂中的羚羊角药材，表明COI基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角方法是可行的，但因羚羊其他器官也含有相同基因，为保证检验结果的准确性，还需配合使用其他检验方法。另外，COI序列也应用于鳖甲[16]、龟甲[17-18]、穿山甲[19]及其混伪品的鉴定研究，为中药材市场监管提供了新的技术手段。

我国蛇类中药应用历史悠久，近年来随着蛇类野生资源逐渐匮乏，加上价格昂贵，药材市场上出现伪品及混淆品的数量甚多，质量问题严重，仅根据外部形态特征很难进行准确的鉴别。崔丽娜等[20]应用COI条形码序列能够鉴定金钱白花蛇及其混伪品，廖婧等[21]收集常见药用蛇类23种，共44个样品，对其COI条形码序列进行测定，各物种种内遗传距离与种间遗传距离有显著差异，系统聚类树中样品可聚类为与分科相一致的3个类群，各物种均形成了相对独立的支，表明COI条形码能够对实验中各药用蛇类物种进行准确鉴定。对10份市场收集的金钱白花蛇生药样品进行鉴定发现，5份为正品，其余5份为伪品，来源于赤链蛇Dinodonrufozonatum，与蛇类专家利用传统形态学方法鉴定的结果一致；且形态学上不能准确鉴别的样品，DNA条形码技术可以迅速鉴别真伪并确定其物种信息。Cao等[22]也应用COI序列对17个种51份蛇的样本进行了鉴定研究，并对10份药材市场样品进行鉴定发现其中5份为伪品。蛇蜕在采集、炮制过程中，很难保持完整的形态，商品药材多数已经破碎，形态鉴定特征不完整，给蛇蜕的形态鉴定带来极大的困难。石林春等[23]应用COI作为DNA条形码，不仅可以鉴定中药材蛇蜕的3种基原，而且可以区分蛇蜕及其易混伪品，表明DNA条形码可以用于中药材蛇蜕的鉴定。

僵蚕药材同时包含动物家蚕和真菌白僵菌，贾静等[24]对市售僵蚕药材进行了DNA条形码鉴定研究，采用植物基因组DNA提取试剂盒能成功扩增白僵菌ITS序列，未能扩增家蚕COI序列，动物基因组DNA提取试剂盒可一次性将家蚕和白僵菌的DNA同时提取出来，有效解决同时含有动物和真菌类药材的基原鉴定。COI序列经鉴定为家蚕BombyxmoriL.，ITS序列经鉴定主要来源为白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant，少数为杂菌。基于COI序列和ITS序列的DNA条形码分子技术能稳定、准确鉴别动物药材僵蚕。

另外，应用COI序列对麝香[25]、蜈蚣[26]、蛤壳[27]、紫河车[28]、海马[29-30]、海龙[29]、水蛭[31]、蛤蚧[32]、桑螵蛸[33]、阿胶原材料驴皮[34]及其混伪品的鉴定研究，均表明COI序列可对正品与混伪品进行准确鉴定，对保障临床用药安全和药材市场监控具有重要意义，整理的具体研究信息见表1。

某些动物药材由于DNA降解比较严重，标准DNA条形码序列获取困难。不同研究者根据标准DNA条形码序列的信息设计特异引物，扩增其中一段长度更短的DNA序列(也称mini-barcode)，应用mini-barcode序列进行物种鉴定，如在蛤蚧[35]、龟甲[36]、羚羊角[37]和冬虫夏草[38]等药材鉴定中已有应用。

表1 动物药材DNA条形码研究信息

续表1

核ITS2序列已被证明在植物类药材鉴定中具有很高的鉴定效率，被选作中草药DNA条形码鉴定的核心序列[48，50]。Yao等[48]对GenBank中12 221条动物的ITS2序列进行分析，ITS2序列长度分布在100～1209 bp，主要分布在195～510 bp，平均长度306 bp，GC碱基含量为48.3%，种间遗传距离大于种内遗传距离，基于BLAST分析发现在物种水平上ITS2的鉴定效率为91.7%。COI序列在Cnidarians和West PalaearcticPandasyopthalmus分类群变异小，甚至没有差异[48]，但ITS2序列对Cnidarians的鉴定效率为77%[2，51]。由于COI等线粒体基因是母系遗传，在动物的鉴定中应纳入核基因等其他相关信息。因此，Yao等[48]提出ITS2可作为COI序列的补充序列对动物进行鉴定。Xiang等[49]应用ITS序列可快速准确鉴定冬虫夏草及12种常见混伪品及近缘物种。陈士林等[52]在大量样本研究的基础上，建立了以COI为主体、ITS2序列为补充的动物药材DNA条形码鉴定体系，该体系已纳入《中国药典》[53]。

2 动物药材DNA条形码鉴定关键技术

动物药材来源复杂，有来自动物的干燥全体(如水蛭、全蝎、蜈蚣、斑蝥、土鳖虫、九香虫等)，有除去内脏的动物体(如地龙、蛤蚧、乌梢蛇、蕲蛇、金钱白花蛇等)，有动物体的某一部分(如鹿茸、鹿角、水牛角、鳖甲、龟甲、鸡内金、哈蟆油等)[1]，DNA存在不同程度的降解，甚至严重的降解，DNA条形码序列能否顺利获得是对动物药材进行鉴定的前提条件。

2.1 样品前处理

动物药材样本因储存环境差异，为避免被其他污染干扰实验结果，一般先用75%乙醇擦拭表面进行消毒或清洗，如鹿类药材[13]、水牛角[14]、穿山甲[19]、僵蚕[24]、蜈蚣[26]、紫河车[28]、海马[30]、蛤蚧[32]等。严华等[34]对阿胶原材料驴皮及其混伪品鉴定时，采用70%乙醇浸泡达到清洁药材表面的目的。乙醇擦拭的样品应放超净工作台上挥干乙醇，部分样品取样时还需通过紫外照射进行消毒，如穿山甲[19]、蟾皮[44]等。

基原动物样本如保存于95%乙醇中，如蛇类或其他动物标本取样时取其肌肉组织，置于蒸馏水中或流水浸泡过夜，以除去乙醇[20-21]。因药材样本的表面DNA易降解或被真菌及寄生虫等污染，取样时需去除外部组织，取药材内部组织进行实验或尽量取其肌肉组织；动物肢体部分因内脏以及食物残留，取样时应避开这些部位。如海马样品用止血钳撕下海马尾部表皮后，割取剥去表皮的尾部药材并剪碎[30]；蛤蚧样品应多取肌肉组织部分，样品的外皮部分与骨骼部分，质地坚硬，不易粉碎，从其中提取基因组DNA比较困难[32]；穿山甲等可取其甲片残留的腹面皮肤组织[19]。取样的前处理及取样部位，直接决定DNA提取的难度和效果，可参考与实验样品最接近的动物药材的相关文献进行操作。

2.2 DNA提取

DNA提取包括破碎细胞、释放核酸、DNA的分离与纯化、DNA浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤。动物药材DNA提取方法目前主要应用试剂盒法、Chelex-100法、磁珠法等[54]。部分动物药材因DNA降解可增大取样量，如水牛角取样60 mg[14]、角甲类药材研究取样达200 mg[9-10]，而哈蟆油药材温水中浸泡体积可膨胀10～15倍，取样时则应进行减量，如5 mg即可获得后续实验要求的DNA[55]。动物药材粉碎前应剪碎或切小，利于充分粉碎。严华等[34]鉴定阿胶原材料驴皮时，其样品为冻干品，质地硬而韧，难以用球磨机直接粉碎，在粉碎时即加入试剂盒中的GA缓冲液，水浴裂解后加入三氯甲烷，除去蛋白质。延长水浴时间对于提高提取效率是一个很有效的方法，如56 ℃水浴2～8 h或过夜，在羚羊角、蜈蚣、紫河车和蛤蚧等药材中都获得很好的提取效果[15，26，28，32]。对于蛋白质含量高的材料，需要加大试剂用量[28]，或用三氯甲烷-异戊醇多次抽提[30，32]，对于脂类含量多的样品，如哈蟆油，加入酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)可有效去除脂肪[55]。对DNA降解严重的动物药材，如角甲类，还可采用该类药材专用的DNA提取试剂盒进行提取，也可获得不错的提取效果[9-10，14]。

刘旭朝等[56]基于SDS法DNA提取原理，对动物药材DNA提取方法进行优化研究。通过对动物干燥全体、角类、骨甲类、组织类、其他类(卵鞘等)等不同用药部位的市售动物药材26种121份样品筛选最佳裂解液配方，结果表明裂解液配方为1% SDS、0.03 mol·L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L-1NaCl时，对不同用药部位动物药材DNA提取效果最佳，并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取，利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足后续实验要求。该裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外的不同用药部位动物药材DNA提取，为动物药材分子鉴定提供了技术支持。杨璐等[57]使用常规定性滤纸作为核酸吸附的载体，通过裂解液的裂解，释放核酸并吸附在滤纸上，利用洗脱液进行核酸纯化，可使整个核酸提取过程在30 s内完成，吸附核酸的滤纸可直接放入反应体系进行扩增，提取得到的核酸经扩增验证，可获得与传统提取方法相一致的检测结果。此方法简单易行、速度快、成本低，可以成功提取不同药用部位的中药材核酸，可使核酸提取变得越来越大众化，不再局限于专业人员和实验室环境。

2.3 PCR扩增与测序

COI序列作为动物的核心DNA条形码，使用通用引物LCO1490/HCO2198对大多数动物类群扩增可获得其COI序列，对于昆虫纲、两栖纲等类群，还可使用文献报道的适用于该类群的扩增引物，具体的引物序列及相关文献见表2。如以上引物还不适用，可应用相关引物设计软件，根据公共数据库中相近物种的COI序列或线粒体全基因组序列进行引物设计。对于DNA降解严重的动物药材，还可设计引物，扩增更短的COI片段进行分析研究[9-10]。作为COI的补充序列，核ITS2序列扩增引物见表2。

表2 动物DNA条形码通用引物序列

PCR扩增体系以25 μL为参照，包括2×PCR Mixture 12.5 μL，10 μmol·L-1正反向引物，模板DNA(约30 ng·μL-1)1 μL，ddH2O补足至25 μL，同时设置未加模板DNA(ddH2O代替)的阴性对照。实际应用中，PCR扩增体系和程序可根据具体情况予以调整。目前，在动物药材的扩增引物方面，通用引物LCO1490/HCO2198不适用于海马、阿胶基原动物驴皮、哈蟆油、九香虫及蕲蛇COI序列的扩增，相关研究人员已设计专属的引物并获得其COI序列[30，34，54，58]。水蛭应用通用引物LCO1490/HCO2198和LepF1/LepR1均可[58]。

PCR扩增产物应用1.2%～2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，应用通用引物扩增COI序列的样品应在约700 bp处有一条单一明亮的条带，阴性对照应无条带。对有扩增条带的PCR产物，在紫外灯下迅速切取目的条带所在位置的凝胶，应用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，应用Sanger测序法进行双向测序，测序引物同PCR扩增引物。

2.4 序列质量评价与分析

双向测序峰图在进行质量评价[50]后进行序列拼接，获得相应的DNA条形码序列。获得的DNA条形码序列首先进行校对，可采用BLAST分析防错、系统树分析防错和barcoding gap检验防错[64]，保证DNA条形码序列的正确。正确的DNA条形码序列，应用CLUSTAL X、CLUSTAL W[65]或MUSCLE等[66]软件进行多序列比对，应用MEGA等[67]软件进行种内、种间遗传距离和系统聚类树分析。

3 动物DNA条形码鉴定数据库

目前应用的动物DNA条形码鉴定数据库主要有GenBank(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)、BOLD(Barcode of Life Database)[68]、中药材DNA条形码鉴定系统[69]和MMDBD(Medicinal Materials DNA Barcode Database)[70-71]等。GenBank为公共数据库，全世界研究者的实验数据都可以上传至GenBank，数据量庞大，但因主要是储存功能，所以对序列的真实性不做判断，因而存在一定的错误率，影响鉴定结果的准确性。BOLD(http：//www.boldsystems.org)是由国际生命条形码协会(The Consortium of Barcode of Life，CBOL)建立的DNA条形码数据库，动物COI序列丰富，目前物种水平的DNA条形码序列包括195 887个物种的3 267 402条COI序列。MMDBD数据库(https：//rdccm.cuhk.edu.hk/mherbsdb/)由香港中文大学邵鹏柱教授团队建立，在2010年建立的MMDBD V1.0版本[70]基础上提高到V1.5版本[71]，目前包括2111个药用物种的62 011条序列。

中药材DNA条形码鉴定系统(http：//www.tcmbarcode.cn)由中国医学科学院药用植物研究所和中国中医科学院中药研究所共同建立[69，72]，目前包含百万余条DNA条形码序列，涵盖中国、日本、韩国、印度、欧盟和美国药典几乎所有草药物种，可进行中药材(动物类、植物类和真菌类)DNA条形码鉴定。贾静等[47]基于中药材DNA条形码鉴定系统对市售鹿茸粉的基原物种进行鉴定发现，其中有38%为《中国药典》规定的正品来源，而62%为其他基原，以驯鹿RangifertarandusL.为主，有些待检样品包装明确标示为梅花鹿鹿茸粉，其鉴定结果为马鹿或驯鹿。应用该系统对市售僵蚕的鉴定研究发现，除白僵菌外，少数为杂菌，且为致病菌株[24]。

4 结语

Miller等[73]认为DNA条形码技术正在推动分类学的“文艺复兴”，能够缓解传统鉴定人才缺乏的现状，完成一些传统形态学和保护生物学无法完成的工作，且技术方法易于掌握，不需要多年的经验积累。动物药材DNA条形码鉴定工作已经有了大量的研究报道，进一步完善动物药材DNA条形码鉴定数据库是今后一个时期的主要任务，并在国家相关主管部门的组织下，尽快开展动物药材DNA条形码标准序列研究工作。随着测序技术的快速发展，应用下一代测序技术开展动物药线粒体基因组测定的技术已经成熟[74]，对于难鉴定的近缘物种可应用线粒体基因组作为“超级条形码”进行区分。另外对中药制剂中动物药材基原物种的鉴定和动物全基因组序列测定研究会越来越多[75-76]，将进一步促进动物药材鉴定研究及其本草基因组学[77]的发展。