韭菜叶绿体的细胞生物学特征

张超越，杨艳鸿，薛雨欣，吴 敏，盖立萍，李海刚，王守箐，刘 林

（临沂大学药学院，山东 临沂 276005）

植物叶绿体白天进行光合作用，光合产物不 能及时运出时就转化为淀粉，以作暂时贮藏，夜间淀粉降解，降解产物再以蔗糖形式转运出叶肉细胞，进入维管束，装载到韧皮部筛管，向植株其他生长部位运输，因而白天积累淀粉是叶绿体的一个典型特征[1-5]。韭菜是栽培广泛的叶类蔬菜作物，为了解韭菜叶的光合产物积累特征，本研究用组织化学和透射电子显微技术对韭菜叶绿体进行了分析。

1 材料和方法

1.1 试验地点

试验于2017—2018年在临沂大学药用植物学实验室进行。

1.2 试验材料

供试韭菜品种为“寿光马蔺韭”，购于临沂种子公司；供试西瓜品种为“京欣”，购于临沂市种子公司。

1.3 试验仪器及药品

仪器：JEOL 1220电子显微镜，奥林巴斯光学显微镜，Ultracut R切片机。

药品：Embed-812树脂，固定剂为四氧化锇，脂染色剂为戊二醛，电子染色剂为柠檬酸铅和醋酸铀。

1.4 试验方法

以西瓜叶作为淀粉检测对照，鉴定韭菜叶中的淀粉。韭菜于4月上旬育苗，6月下旬定植到大田，翌年5月取样。西瓜于3月初播种于营养钵，4月移栽于大田。考虑到叶绿体白天进行光合作用、合成淀粉[2,4]，选择晴朗天11：00取韭菜和西瓜植株新鲜幼叶和成熟叶进行淀粉鉴定和叶绿体超微特征分析。

1.4.1 淀粉组织化学鉴定方法

碘法[6]：样品切成0.5 mm×0.5 mm小片，用2%戊二醛固定液（0.05 mol/L磷酸缓冲液配制，pH值 6.8）固定3 h，用1%四氧化锇固定2 h，用碘-碘化钾溶液染色2 h，然后脱水、树脂包埋、切片，切片用苯胺蓝复染，显微镜下如有淀粉则显示蓝色，同时也显示出细胞结构。

锡夫试剂法[7]：样品切成0.5 mm×0.5 mm小片，用2%戊二醛固定液固定3 h，用1%四氧化锇固定2 h，洗涤后在0.5%高碘酸（0.3%硝酸配制）中浸1 h，自来水洗5 min，锡夫试剂中3 h，用偏亚硫酸氢钠溶液洗涤3次，每次5 min，自来水洗20 min，然后脱水、树脂包埋、切片，厚度1.0～1.5 μm，显微镜下观察，如有淀粉存在则会呈现为红色颗粒。切片经苯胺蓝染色，则在显示淀粉的同时也显示细胞结构。

1.4.2 透射电子显微技术

从大田韭菜和西瓜植株上分别剪下幼叶和成熟叶的部分叶片，浸入2%戊二醛固定液，回到实验室内切去受损伤的边缘，修成小于 1 mm×1 mm小块，再放入2%戊二醛固定液，固定4 h。样品用缓冲液洗涤3次，再用1%四氧化锇溶液固定4 h。样品用梯度酒精脱水，以丙酮置换酒精，包埋于Embed-812树脂中。包埋块用钻石刀切片，切片厚度60 nm，用5%醋酸铀染色20 min，再用0.1%柠檬酸铅染色2 min，JEOL1220透射电子显微镜下观察韭菜和西瓜叶肉细胞、表皮细胞和维管组织细胞中的叶绿体和淀粉。

2 结果与分析

2.1 淀粉鉴定结果

2.1.1 组织化学鉴定结果

如表1所示，用碘-碘化钾和锡夫试剂检测淀粉，韭菜幼叶和成熟叶都呈阴性反应，表明不含淀粉；经锡夫试剂和苯胺蓝染色后，叶肉细胞叶绿体染色深且均匀（图1 A），表明叶绿体内蛋白质丰富，但不含淀粉。同样用碘-碘化钾和锡夫试剂检测，西瓜幼叶和成熟叶都呈阳性反应，显示含有淀粉。用锡夫试剂和苯胺蓝染色后，叶绿体着色不均匀，淀粉粒着色较深，叶绿体其他区域染色较浅（图1 B）。

2.1.2 电子显微镜鉴定结果

电镜下观察，如表2所示，韭菜成熟叶和幼叶叶肉细胞中的叶绿体（图1 C）、维管薄壁细胞中的质体（图1 F）和表皮细胞中的质体（图1 G）都没有积累淀粉。与韭菜叶绿体形成鲜明对比，西瓜不仅幼叶和成熟叶叶肉细胞的叶绿体含有淀粉（图1 H），而且维管薄壁细胞中的质体（图1 I）和表皮细胞中的质体（图1 J）也含有淀粉。

2.2 韭菜叶绿体的超微特征

韭菜叶绿体呈椭球形，大小约3 μm×5 μm，含大量类囊体，类囊体构成大量基粒，每个基粒都含有很多平行堆叠的类囊体（图1 C—E）。在生长旺盛的幼叶片内，类囊体膜电子染色较浅，比基质着色能力弱，因此呈现负染色（图1 C、D）；在成熟叶片内，类囊体膜染色较深，比基质着色能力强（图1 E）。叶绿体含质体小球（质体内的脂滴），小球电子染色较浅。

表1 淀粉组织化学鉴定结果

表2 淀粉的电镜观察结果

维管薄壁细胞以辅助光合产物运输和向韧皮部装载为主要功能，这些细胞含有体积很小的质体，呈棒状，大小约0.4 μm×1.2 μm，含少量类囊体，缺少典型基粒，显然没有分化成叶绿体（图1 F），属于原质体。以保护为功能的表皮细胞中的质体也很小，也呈棒状，约为0.4 μm×1.2 μm，结构简单，没有分化成叶绿体，仍属于原质体。

3 结论与讨论

组织化学和电镜技术研究结果表明，韭菜幼叶和成熟叶叶肉细胞中的叶绿体不含淀粉，以辅助光合产物运输并向韧皮部筛管装载为主要功能的维管薄壁细胞及以保护为功能的表皮细胞中未分化成叶绿体的质体也不积累淀粉。而用同样方法检测，西瓜幼叶和成熟叶不仅叶肉细胞中的叶绿体含有淀粉，维管组织和表皮中没有分化成叶绿体的质体也含有淀粉。显然，韭菜叶绿体没有合成淀粉的能力，这是韭菜叶绿体的一个突出细胞生物学特征。此外，韭菜幼叶和成熟叶叶绿体的类囊体膜电子染色能力不同，幼叶类囊体膜电子染色深，成熟叶类囊体膜染色浅，这是韭菜叶绿体的另一个细胞生物学特征。

在韭菜叶中检测不到淀粉，洋葱和大蒜叶中也没有检测到淀粉[8]，因此不积累淀粉可能是葱属植物的一个共同特征，但这一推测尚需要对更多其他葱属植物进行研究。

韭菜叶表皮和维管薄壁细胞中的原质体不积累淀粉，一个有趣的问题是根冠细胞中的质体是否含有淀粉。根冠细胞中的淀粉体在根对重力信号感受过程中起重要作用，是维持根向地性所不可缺少的，根冠失去淀粉，根就失去向地性[9]。如果韭菜根冠细胞中不含淀粉，那么韭菜根感受重力的机制就与其他植物不同。

图1 韭菜与西瓜叶片显微与超微图片

不同发育阶段类囊体膜的着色能力有显著差异，这是由膜蛋白的多少引起的，膜蛋白越多，膜的着色能力越强。在叶片旺盛生长阶段，类囊体膜系统正处在快速建立阶段，膜结合蛋白较少，因此膜着色能力较弱。而在成熟叶片内，类囊体膜上的光合系统业已建立，类囊体膜结合蛋白多，所以着色能力较强。膜蛋白主要是参与构成光合作用装置的蛋白质，如光合电子传递链、ATP合酶等。因此，类囊体膜电子染色深意味着叶绿体光合作用能力较强，染色浅则意味着光合能力较弱。