拮抗剂方案OPU-ICSI不同时机选择对新鲜胚胎移植周期临床结局的影响

陈威，周莉娜，吴煜，张箴波，孙健

辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）已广泛应用于治疗不孕，根据患者不同情况合理选择控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）以获得高质量的胚胎以及合适的子宫容受性是提高体外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）的临床妊娠率的关键环节。近年促性腺激素释放激素拮抗剂（gonadotropin releasing hormone antagonist，GnRHA）促排卵方案促排卵时间短，用药少且无“flare-up”效应，降低了卵巢过度刺激综合征的发生率，已广泛应用于临床[1]。

COS后，手术获取的卵母细胞胞核成熟的一致性是卵母细胞发育潜能的重要影响因素[2]。卵母细胞细胞核的成熟以排出第一极体为标准，然而涉及到大量细胞器重新编排的细胞质的成熟目前还没有稳定的、非侵袭性的判断方法[3]。因而相关学者对可能影响胞核成熟时机的取卵（oocyte pick-up，OPU）与胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）的时间间隔（OPU-ICSI）的选择进行了大量的研究，一些研究认为OPU后将卵子培养2～3 h再实施ICSI能增加受精率和提高胚胎质量[4-6]。而Falcone等[7]研究发现OPU后6 h再实施ICSI对胚胎的分裂率、生化妊娠率和临床妊娠率均有显著提高。这些研究都提示人的卵母细胞存在一个相对狭窄的最佳受精窗口时间，这个时机的选择将会对后续卵母细胞受精及胚胎质量产生重要的影响[8]。之前的研究大多以长方案为主[8-10]，然而GnRHA方案下ICSI的时机选择还未见报道。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2016年1月—2018年5月在上海交通大学附属第一人民医院生殖医学科（我科）采用GnRHA方案促排卵，行新鲜胚胎移植的531个周期。ICSI治疗的原因包括男性因素（严重少弱畸精症、梗阻性无精症及非梗阻性无精症）和IVF受精失败史等原因，剔除女性年龄＞40岁的病例。比较两种不同ICSI时机（OPU-ICSI为38～40 h和41～43 h）对新鲜胚胎移植周期中卵子成熟度，胚胎质量和相关妊娠结局的影响。该回顾性研究的实施符合《赫尔辛基宣言》和医院的相关伦理要求。

2.2 研究方法

2.2.1 GnRHA方案 从月经周期第2日起注射促性腺激素（Gn），当有≥1个优势卵泡直径≥14 mm时添加GnRHA（思则凯，默克雪兰诺，0.25 mg/d）。Gn起始剂量一般为150～225 IU/d，根据B型超声（B超）监测卵泡情况以及血雌二醇（E2）水平调整Gn剂量，当优势卵泡中至少有3个直径≥18 mm时停用Gn，并于当晚注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，珠海丽珠公司）6 000 IU。hCG注射36 h后超声引导下经阴道穿刺取卵，常规行ICSI，移植第3日或第5日胚胎1～2个。

2.2.2 实验室方案 OPU后2 h将卵丘复合物移入预热的透明质酸酶（Vitrolife，瑞典）中消化35 s，转移至配子培养液中，用毛细管吹打脱去颗粒细胞，将脱颗粒细胞后卵母细胞置于胚胎培养液（G1+，Vitrolife，瑞典）中，37 ℃、6%CO2、5%O2条件下继续培养。其中hCG-ICSI间隔38～40 h为组1（n=101），间隔41～43 h为组2（n=430）。

在Gamete（Vitrolife，瑞典）液滴中用Holding针将MⅡ卵母细胞固定，将极体置于12点位置，在聚乙烯吡咯烷酮（PVP，Vitrolife，瑞典）微滴中选择形态正常、活动力好的精子制动后行ICSI。将注射完成的卵母细胞经充分洗涤后移入12.5 μL G1+胚胎培养微滴中，在37 ℃、6%CO2、5%O2培养箱中培养。胚胎评级根据英国伯恩霍尔生殖医学中心（Bourn Hall Clinic）的胚胎分级，依据胚胎卵裂球数目、细胞质均一性、碎片多少等进行胚胎分级，第2天4≤胚胎卵裂球数目≤6，无明显大小不均，碎片数小于20%；第3天6＜卵裂球数目≤10、无明显大小不均，碎片＜20%为优质胚胎。

2.3 妊娠结局判断 移植后14 d测定血β-hCG，阳性者为生化妊娠，移植后28 d阴道超声检查见妊娠囊及胎心搏动确定为临床妊娠。出现胚胎停止发育或者自然流产计为流产。本文统计中的妊娠均为临床妊娠。

2.4 统计学方法 所有数据用SPSS 17.0统计软件进行分析。定量资料正态分布的数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；非正态分布的数据用中位数（百分位数）[M（P25，P75）]表示，组间比较用秩和检验。定性资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组患者基本资料比较 2组患者的年龄、不孕时间、体质量指数（BMI）、基础卵泡刺激素（bFSH）、Gn使用时间、Gn总量和hCG日E2水平比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

2.2 2组患者胚胎质量比较 2组患者的获卵数、受精率、分裂率、可利用胚胎率和优胚率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。2组患者卵子成熟率比较，差异有统计学意义（χ2=4.460，P=0.035），见表2。

2.3 2组患者妊娠结局比较 2组患者胚胎移植数、妊娠率、种植率和多胎妊娠率比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。2组患者早期流产率比较，差异有统计学意义（χ2=3.980，P=0.046），见表3。

3 讨论

研究表明人卵母细胞存在很窄的最佳受精时间窗，那么ICSI受精实施的时机对于胚胎质量的影响可能就是一个非常重要的影响因素[8]。本研究发现，GnRHA方案中38～40 h和41～43 h的hCG-ICSI时间间隔实施ICSI虽然对胚胎质量和临床妊娠率没有影响，但是2组患者的早期流产率差异有统计学意义（χ2=3.980，P=0.046）。

本研究发现除2组患者卵子成熟率比较差异有统计学意义外，2组的胚胎质量和临床妊娠率均无差异。组2患者hCG-ICSI为41～43 h能获得更多的成熟卵母细胞，可能与拮抗剂COS中大小卵泡成熟不够一致有关。Nogueira等[11]研究发现拮抗剂方案中卵母细胞的成熟度差异较大，小卵泡中获得的成熟卵母细胞产生发育较差胚胎的可能大于从较大卵泡中得到的卵母细胞。Van de Velde等[12]研究表明，增加取卵后卵丘卵母细胞复合体培养时间并无改善ICSI的结局。 Bárcena等[13]将OPU-ICSI的间隔时间从85.8～703.6 min分为10组进行分析，均未发现各组间胚胎质量和临床结局有差异。

表1 2组患者基本资料比较

表2 2组患者胚胎质量比较

表3 2组患者妊娠结局比较

Dozortsev等[8]研究表明在长方案促排卵周期中hCG-ICSI时间间隔在＞39 h组比37～39 h组的种植率和受精率高，而且hCG-ICSI时间间隔小于37 h的早期流产率较高（35%）。殷宝莉等[9]研究发现在长方案促排卵周期中，hCG-ICSI时间间隔＜40 h组中同样出现均高于其他分组20%早期流产率。本研究在拮抗剂方案中未发现特定的OPU-ICSI时间间隔对临床结局有明显的影响，但是同样发现OPU-ICSI间隔在（38～40 h），早期流产率偏高。这可能与卵子核质成熟不同步，ICSI过早实施引起胚胎染色体异常有关。本研究结果与上述研究有一定差异，可能有以下两个因素：①本研究选取OPU-ICSI时间间隔为38～43 h，虽然包括大部分胚胎学家实施的ICSI时机方案，但由于其他时间段的病例数和其他超排方案病例过少未能纳入研究中。②由于本生殖中心的男性患者严重少弱畸精症、显微手术取精和手术后冻融精子占60%以上，对胚胎质量和临床结局有直接影响。

综上，GnRHA方案中OPU-ICSI为38～40 h和41～43 h实施ICSI新鲜胚胎移植周期，OPU-ICSI为41～43 h组能得到更多的成熟卵母细胞，2组虽然胚胎质量及临床妊娠结局无差异，但是OPU-ICSI为41～43 h组早期流产率低于38～40 h组。本研究不足之处在于仅对GnRHA方案新鲜胚胎移植周期中的应用进行了比较，而未加入冷冻胚胎移植和不同移植胚胎数目进行细分组研究。在将来的研究中，应加大样本量并进行细致分组，综合卵母细胞成熟和质量等因素更加全面地分析，为临床提供相应的数据参考。