甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症患儿基因突变分析

贾立云，封纪珍，王熙，马翠霞，封露露

甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）是我国最常见的有机酸血症，多数为常染色体隐性遗传，极少部分为伴X隐性遗传，临床表现为神经、血液、肝脏、肾脏和皮肤等多系统损伤，若不及时治疗，其致死率、致残率均很高[1]。MMA发病机制主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl-CoA mutase，MCM）自身缺陷或其辅酶钴胺素代谢缺陷，导致甲基丙二酸、3-羟基丙酸及甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积[2]。MCM根据缺陷程度分为完全缺陷（complete mutase deficiency，mut0） 及部分缺陷（partial mutasedeficiency，mut-）[3]。钴胺素代谢障碍包括5类：两种为腺苷钴胺素（AdoCbl）合成缺陷，即线粒体钴胺素还原酶（mitochondrial cbl reductase，cblA）缺乏和线粒体钴胺素腺苷转移酶（mitochondrial cobalamin adenosyltransferase，cblB）缺乏；3种为胞质和溶酶体钴胺素代谢异常所致腺苷钴胺素和甲基钴胺素（MeCbl）合成缺陷（cblC，cblD，cblF）[4-6]。其中cblA、cblB、cblC、cblD和cblF相应编码基因分别为MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC及LMBRD1。Mut0、mut-、cblA和cblB仅表现为MMA，故称为单纯MMA，而cblC、cblD和cblF则导致腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成缺陷，同时血同型半胱氨酸增高，故称为MMA合并同型半胱氨酸血症[7]。其中MMACHC基因突变导致的cblC型是最常见的类型，为常染色体隐性遗传[8-9]。此外，李东晓等[10]还发现罕见的X染色体转录辅助调节因子HCFC1突变导致的MMAcblX型家系。MMA患儿临床表现复杂，识别困难，需依靠生化和基因进行确诊[11]。

串联质谱技术以及新一代测序技术推广应用，使得新生儿遗传代谢病筛查率不断提高，且越来越多的MMA患儿得到了早期诊断和治疗，提高了患儿的生存质量，并且再生育指导及产前诊断也可减少MMA患儿出生。石家庄市新生儿疾病筛查诊治中心自2014年1月开展了串联质谱筛查技术，截止到2018年3月共计筛查113 810例活产新生儿，确诊了25例MMA患儿，其中11例进行了基因检测，3例为单纯型MMA，8例为合并型MMA。进而对8例合并型患儿进行MMACHC和HCFC1基因突变分析，为产前诊断提供理论依据，并结合临床症状及预后对基因型与表型之间关系进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料 石家庄市新生儿疾病筛查诊治中心自2014年1月—2018年3月出生的113 810例活产新生儿进行遗传代谢病筛查。所有新生儿家长或监护人均签署知情同意书，研究内容经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 串联质谱技术 用打孔器取直径3 mm质控样本和待测样本血斑，置于U型底96孔微孔板中。每孔加入90μL萃取工作液，30℃，700 r/min震荡孵育45 min。转移75μL上清液至V型底96孔板的对应位置，覆上铝箔以减少挥发。将V型板放入自动进样器中，建立样品列表，采用多反应监测模式进行检测，采用MassLynxV4.1软件分析系统，通过比较分析物和内标分析物的信号积分面积来进行浓度值计算。

1.2.2 筛查流程 （1）血丙酰基肉碱＞4.7μmol/L；丙酰基肉碱/乙酰基肉碱＞0.2；丙酰基肉碱/游离肉碱＞0.2判读为初筛阳性，需召回进行二次采血复查。（2）复筛阳性患儿经尿气相色谱质谱进行尿有机酸检测、血同型半胱氨酸检测、维生素B12负荷试验进行确诊并分型，并对患儿治疗情况及体格发育、智能发育进行定期随访。

1.2.3 基因测序分析 经知情同意，抽取患儿及部分父母外周静脉血各4 mL，2%乙二胺四乙酸抗凝，提取DNA，采用二代测序技术基因突变分析。为避免假阳性，对于检测到的变异采用Sanger直接测序法进行验证。

2 结果

2.1 MMACHC和HCFC1基因检测结果及突变频率分析 113 810例活产新生儿中确诊了25例MMA患儿，其中11例做了基因检测，3例为单纯型MMA；8例为合并型MMA。8例合并型MMA患儿中6例均检测到MMACHC基因突变，1例检测到MMACHC和HCFC1基因突变，1例检测到HCFC1基因突变。共检测到11种基因突变位点，已报道位点8种，分别是C.666C＞A、C.482G＞A、C.656＿658delAGA、c.609G＞A、C.80A＞G、C.394C＞T、C.440＿441del和C.599G＞A；未见报道位点3种，分别是C.239A＞G、C.4535A＞T和C.4442C＞T（见图1）。基因突变频率分析表明C.482G＞A为热点突变位点，突变频率为0.25，突变频率最高的外显子为第4外显子，突变频率为0.55，见表1。

2.2 基因型与预后关系 经随访，8例合并型患儿1例于生后10 d夭折（例8），基因型为C.656＿658delAGA/C.440＿441del；2例患儿未用药，定期观察(例1、例5)，基因型分别为C.239A＞G/C.666C＞A、C.4442C＞T杂合突变；5例接受维生素B12（肌内注射1 mg/次，每周2～3次）、左卡尼汀200～500 mg/（kg·d）、甜菜碱100～500 mg/（kg·d）、亚叶酸钙5～15 mg/d治疗患儿中，3例发育迟缓（例3、例4、例7），基因型分别为C.599G＞A/C.656＿658delAGA/C.4535A＞T、C.609G＞A/C.609G＞A、C.80A＞G/C.394C＞T；其余2例C.482G＞A/C.482G＞A纯合突变患儿无异常表现（例2、例6），见表2。

3 讨论

3.1 MMA的发病机制及常见临床症状 MMA是一种最常见的先天性有机酸血症，多数为常染色体隐性遗传，极少部分为伴性遗传，发病机制为甲基丙二酰辅酶A变位酶或其辅酶腺苷钴胺素代谢缺陷，导致甲基丙二酸、3-羟基丙酸及甲基枸橼酸等代谢物异常蓄积，引起多脏器损伤[12]。新生儿至成人均可发病[13]。早发型患儿多在1岁内起病，以神经系统症状为主，常伴发血液系统及胃肠道功能障碍。迟发型患儿可在1岁后起病，常合并脑、外周神经、肝、肾、眼及血管等多系统损害，运动障碍表现突出[1]。MMA临床表型及基因型复杂，MMACH缺陷导致的cblC型是MMA合并同型半胱氨酸血症的主要类型，患儿需给予维生素B12、左卡尼汀、甜菜碱及亚叶酸钙对症治疗，提高患儿生存质量，改善病情[14]。此外，除遗传缺陷外，母亲长期维生素B12摄入不足造成胎儿维生素B12缺乏，不仅引起母亲恶性贫血，亦将导致新生儿继发性MMA，导致造血功能障碍和神经系统发育异常[15]。

图1 MMA患儿MMACHC、HCFC1基因突变图

表1 8例MMA伴同型半胱氨酸血症患儿基因MMACHC、HCFC1突变检测结果分析

表2 8例MMACHC、HCFC1基因突变患儿基因型与临床表型关系

3.2 MMA患病率及基因突变位点分析 MMA患病率在不同国家报道存在很大差异，国内报道显著高于国外。美国患病率为2.1/10万；德国为0.59/10万；意大利为0.87/10万；日本为2/10万[16]；而我国上海新生儿疾病筛查中心统计的患病率为3.6/10万[17]；浙江省为2.2/10万[18]；河南省为16.6/10万[19]；山东聊城地区为20/10万[20]；本研究对2014年1月—2018年3月石家庄市出生的113 810例活产新生儿行串联质谱筛查，确诊25例MMA患儿，患病率为22/10万，接近山东聊城地区。表明MMA患病率亦在同一国家不同地区存在差异，具有地域性。

确诊的25例患儿中，11例患儿做了基因检测，3例为单纯型MMA，8例为合并型MMA，其中7例为cblC型。cblC的编码基因MMACHC位于1p34.1，含5个外显子，外显子1～4是编码区，长849 bp，编码282个氨基酸，外显子5为非编码区[21]。基因长10 736 bp，已发现50余种MMACHC基因突变，多数位于外显子3和4上[22]。8例患儿中2例携带HCFC1基因突变。本研究对8例合并型患儿MMACHC、HCFC1基因进行检测发现11种突变位点，其中9种为cblC型，多数位于外显子4上；2种为cblX型，分别位于外显子18和19。关于cblC型MMA已有文献报道[9，23-24]，而cblX型报道极少[10]。此外，本研究发现已报道的突变位点8种，分别为C.666C＞A、C.482G＞A、C.656＿658delAGA、c.609G＞A、C.80A＞G、C.394C＞T、C.440＿441del和C.599G＞A。c.609G＞A为无义突变，可造成cblC蛋白第203位色氨酸翻译提前终止；C.656＿658delAGA为整码突变，导致cblC蛋白第220位赖氨酸缺失，二者均产生截短蛋白，从而造成cblC蛋白功能缺陷，常早发，临床表型较重，且预后差[25]。C.482G＞A突变使得cblC蛋白第161位氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺，对蛋白功能影响较小，有文献报道该位点与晚发型MMA有关，临床表型较轻[25]。C.80A＞G突变使得cblC蛋白第27位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸，国内有文献报道对于以气促、呼吸困难起病的不明原因肺动脉高压和高血压患儿应注意代谢性疾病的可能；心血管系统受累的严重程度可能是影响合并型MMA预后的重要原因；患儿心血管系统受累可能主要与MMACHC基因c.80AG突变有关[26]。C.394C＞T突变使得cblC蛋白第132位精氨酸翻译提前终止，产生截短蛋白，有文献报道携带此突变患儿存在喂养困难、精神不佳等临床特征[27]。C.666C＞A突变使得cblC蛋白第222位酪氨酸翻译提前终止，携带该突变患儿可表现呕吐与吸吮不良，嗜睡和肌张力减退[28]。C.440＿441del为移码突变，导致147位甘氨酸及之后氨基酸的整体改变[29]。C.599G＞A为无义突变，使第200位色氨酸变为终止密码子，使肽链合成提前终止[30]。

此外，本研究还发现未见报道的突变位点3种，分别为C.239A＞G、C.4535A＞T和C.4442C＞T。其中C.239A＞G为错义突变，导致第80位天冬氨酸变为甘氨酸；C.4535A＞T为错义突变，使第1 512位谷氨酰胺变为亮氨酸；C.4442C＞T为错义突变，使第1 481位苏氨酸变为甲硫氨酸。对突变位点的遗传方式进行对比分析，发现11种突变位点中，9种突变为常染色体隐性遗传，2种为伴X隐性遗传。

3.3 合并型MMA MMACHC、HCFC1基因型与临床表型关系探讨 近年对MMACHC基因型与临床表现的研究认为两者存在一定关系[17，31-32]。本研究发现的8例合并型患儿临床表型及预后存在不同程度的差异。基因型为C.656＿658delAGA/C.440＿441del患儿1例，于生后10 d夭折；基因型分别为C.599G＞A/C.656＿658delAGA/C.4535A＞T、C.80A＞G/C.394C＞T患儿2例，发育迟缓，主要变现为大动作晚；基因型为C.609G＞A/C.609G＞A患儿1例，为晚发型，3岁左右反应差，吐字不清；其余4例患儿无异常表现。与临床症状及预后结合分析表明C.656＿658delAGA/C.440＿441del基因型致病性较强，基因型C.599G＞A/C.656＿658delAGA/C.4535A＞T、C.80A＞G/C.394C＞T预后较差。

MMA临床表现复杂，致死率、致残率高，国内以cblC和MUT为主[32]。石家庄市MMA患病率高于国内外报道，因此，在新生儿期开展液相串联质谱筛查，可使患儿得到早发现、早治疗，改善患者生存质量。然而患儿预后与其基因突变位点有关，本研究对8例合并型患儿的11种基因突变位点分析发现C.482G＞A为石家庄市MMA合并同型半胱氨酸血症患儿的热点突变，但预后较好，而C.656＿658delAGA突变位点致病性较强。此外，共检测到3种尚未报道的基因突变位点，进一步丰富了我国MMA患儿基因突变谱，且为先证者家系产前诊断提供依据。