PI3K/Akt信号通路对肺泡上皮钠通道α亚基表达的影响*

邓 旺，李长毅，王导新

(重庆医科大学附属第二医院呼吸内科 400010)

肺泡上皮钠通道(epithelial sodium channel，ENaC)表达于Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞，由α、β和γ 3个亚基组成。目前研究认为清除肺泡腔内水肿液的主要机制是通过ENaC完成钠离子从顶膜到基底膜侧主动转运过程[1]。有效清除肺泡腔内过多的水肿液，维持肺泡腔相对干燥，是治疗急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和决定其预后的关键[2]。研究显示，α-ENaC基因敲除的小鼠因不能有效清除肺水肿液于出生后40 h死亡，因此α-ENaC可能是影响肺水肿液清除的主要亚基[3]。磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号转导是一条能减轻ARDS肺水肿的保护性通路[4]。但PI3K/Akt 信号通路参与肺水肿液清除的机制是否通过调控α-ENaC的表达来实现目前尚不清楚。本研究通过体外培养A549细胞(肺上皮细胞)，探讨PI3K/Akt信号通路调控α-ENaC表达的作用。

1 材料与方法

1.1材料 肺上皮细胞A549及培养基RPMI1640购自重庆医科大学生命科学院。重组人胰岛素购自美国礼来公司。LY294002购自美国Sigma公司。总RNA提取试剂盒和反转录PCR(RT-PCR)试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。α-ENaC及β-actin购自英国Abcam公司。Akt及磷酸化Akt(p-Akt)抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组 A549细胞培养于RPMI1640培养基中(含10%小牛血清)，然后放入37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。胰蛋白酶消化传代，细胞贴壁100%开始干预。实验分组：对照组细胞在不含10%小牛血清的培养基培养；胰岛素组细胞在不含10%小牛血清的培养基中分别给予胰岛素2、20、200 mU/L培养120 min，另加入胰岛素200 mU/L培养30、60、120 min；LY294002组细胞在不含10%小牛血清的培养基中加入胰岛素200 mU/L和LY294002 10 μmol/L(抑制PI3K/Akt通路[5])培养2 h。

1.2.2RT-PCR检测α-ENaC mRNA表达 用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，按说明书进行。PCR引物序列：α-ENaC(509 bp)上游引物5′- TAC CCT TCC AAG TAT ACA CAG C-3′，下游引物5′-CAG AAG GAG ACT CCG AAT TAG T-3′；β-actin(871 bp)上游引物：5′-GTA CAA CCT TCT TGC AGC TCC T-3′，下游引物：5′-ACA GGA TTC CAT ACC CAG GAA G-3′。PCR反应条件：预变性94 ℃ 1 min，变性94 ℃ 30 s，退火53 ℃(α-ENaC)和55 ℃(β-actin)30 s，72 ℃ 1 min，30个循环。PCR产物8 μL与上样缓冲液混匀，1.2%琼脂糖上进行凝胶电泳。应用凝胶成像系统(Bio-Rad)成像，Quantity One软件分析目的条带灰度，以目的条带与β-actin比值作为结果进行比较。

1.2.3蛋白质印迹法检测α-ENaC蛋白表达 提取各组细胞蛋白，取35 μg总蛋白经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h后，分别与α-ENaC(1∶300)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗体4 ℃孵育过夜。然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1.5 h，电化学发光法(ECL)显色。凝胶成像系统扫描，Quantity One软件分析目的条带吸光度值，以目的条带与β-actin比值作为结果进行比较。

2 结 果

2.1不同浓度胰岛素对α-ENaC mRNA表达的影响 2、20、200 mU/L胰岛素作用A549细胞2 h后，α-ENaC mRNA的相对表达水平分别为(0.331±0.032)、(0.588±0.014)、(0.739±0.029)，随胰岛素浓度增加而增加，与对照组α-ENaC mRNA的相对表达水平(0.131±0.021)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Marker：标记物；1：对照组；2：胰岛素2 mU/L组；3：胰岛素20 mU/L组；4：胰岛素200 mU/L组

图1不同浓度胰岛素对α-ENaC mRNA表达的影响

2.2不同浓度胰岛素对α-ENaC蛋白及p-Akt表达的影响 2、20、200 mU/L胰岛素作用A549细胞2 h后，α-ENaC蛋白表达水平分别为(1.043±0.079)、(1.239±0.092)、(1.924±0.056)，随胰岛素浓度增加而增加，与对照组α-ENaC蛋白表达水平(0.820±0.037)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2A。p-Akt水平随胰岛素浓度增加而增加，2、20、200 mU/L胰岛素作用后p-Akt水平分别为(0.054±0.006)、(0.069±0.005)、(0.125±0.008)，与对照组p-Akt水平(0.021±0.002)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2B。

A：α-ENaC蛋白表达水平；B：p-Akt表达水平；1：对照组；2：胰岛素2 mU/L组；3：胰岛素20 mU/L组；4：胰岛素200 mU/L组

图2不同浓度胰岛素对α-ENaC蛋白及p-Akt表达水平的影响

2.3胰岛素作用不同时间对α-ENaC mRNA表达的影响 200 mU/L胰岛素作用30、60、120 min后，α-ENaC mRNA的相对表达水平分别为(0.437±0.035)、(0.534±0.048)、(0.916±0.069)，随胰岛素作用时间增加而增加，与对照组α-ENaC mRNA表达水平(0.818±0.008)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.4胰岛素作用不同时间对α-ENaC蛋白及p-Akt表达的影响 200 mU/L胰岛素作用30、60、120 min后，α-ENaC蛋白表达水平分别为(0.544±0.036)、(0.678±0.028)、(0.879±0.069)，随胰岛素作用时间增加而增加，与对照组α-ENaC蛋白表达水平(0.424±0.042)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4A。p-Akt水平随胰岛素作用时间增加而增加，200 mU/L胰岛素作用30、60、120 min后，p-Akt水平分别为(0.045±0.006)、(0.089±0.007)、(0.176±0.027)，与对照组p-Akt水平(0.019±0.005)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4B。

Marker：标记物；1：0 min；2：30 min；3：60 min；4：120 min

图3胰岛素作用不同时间对α-ENaC mRNA表达的影响

A：α-ENaC蛋白表达水平；B：p-Akt表达水平；1：0 min 2：30min 3：60min 4：120min

图4胰岛素作用不同时间对α-ENaC蛋白及p-Ak表达水平的影响

2.5LY294002干预后对α-ENaC mRNA表达的影响 200 mU/L胰岛素作用A549细胞2 h后，α-ENaC mRNA相对表达水平高于对照组[(0.689±0.033)vs. (0.472±0.048)，P<0.05]。10 μmol/L LY294002 作用后，明显抑制了α-ENaC mRNA的表达[(0.176±0.035)vs. (0.689±0.033)，P<0.05]，见图5。

Marker：标记物；1：对照组；2：胰岛素200 mU/L组；3：LY294002组

图5 LY294002干预后对α-ENaC mRNA表达的影响

2.6LY294002干预后对α-ENaC蛋白及p-Akt表达的影响 胰岛素(200 mU/L)作用A549细胞2 h后，α-ENaC蛋白表达水平明显高于对照组[(1.271±0.064)vs. (0.773±0.052)，P<0.05]；10 μmol/L LY294002作用后，明显抑制了α-ENaC蛋白表达[(0.354±0.034)vs. (1.271±0.064)，P<0.05]，见图6A。与对照组相比，胰岛素作用后p-Akt水平明显升高[(0.144±0.008)vs. (0.030±0.005)，P<0.05]；LY294002 作用后，明显抑制了胰岛素引起的Akt磷酸化，p-Akt水平降低[(0.017±0.004)vs. (0.144±0.008)，P<0.05]，见图6B。

A：α-ENaC蛋白表达水平；B：p-Akt表达水平；1：对照组；2：胰岛素200 mU/L组；3：LY294002组

图6 LY294002干预后对α-ENaC蛋白及p-Akt表达水平的影响

3 讨 论

肺毛细血管通透性增加导致肺泡腔内大量水肿液形成是ARDS发生、发展的重要病理生理过程。学界对ARDS进行了大量的基础与临床研究，但因其发病机制复杂，目前仍然缺乏有效的治疗措施。研究显示，上调ENaC的表达能有效清除肺泡腔内聚集的水肿液，维持气体交换，改善顽固性低氧血症，对治疗ARDS具有重要意义[7]。其中，α-ENaC在肺泡上皮细胞中含量最高，是维持钠水转运及肺水肿液清除的关键亚基。

PI3K参与细胞生长、分化及代谢调节，在细胞信号转导中发挥重要作用。Akt是PI3K信号转导的下游中心环节，同时也是胰岛素发挥效应的主要通路[8-9]。研究显示，PI3K参与调控胰岛素作用下的肾脏上皮细胞ENaC的表达，但其下游的信号转导机制并没有阐明[10]。PI3K/Akt信号通路参与调控ARDS的炎性反应，减轻肺水肿及肺损伤[11]。但此通路是否调控γ-ENaC的mRNA和蛋白表达还未见相关报道。

本研究显示，不同浓度的胰岛素(2、20、200 mU/L)分别干预A549细胞后，α-ENaC mRNA和蛋白表达同步上调，其变化趋势呈现剂量-效应依赖关系，同时Akt磷酸化水平也同步增加。说明胰岛素激活PI3K/Akt信号通路后，α-ENaC的基因转录及蛋白表达水平增加。同样，经过胰岛素作用不同时间后，α-ENaC mRNA和蛋白表达呈现时间-效应依赖性增加，Akt磷酸化水平与α-ENaC表达变化趋势一致，进一步证明了激活PI3K/Akt信号通路，上调α-ENaC表达的作用。本实验中，阻断PI3K/Akt通路后，α-ENaC mRNA和蛋白表达下降，Akt磷酸化水平也同步下降，表明胰岛素通过激活PI3K/Akt通路上调α-ENaC的表达。研究结果从体外实验证明了PI3K/Akt信号通路调控α-ENaC表达的作用，与前期体内研究结果一致[12]。

综上所述，PI3K/Akt信号通路调控肺泡上皮细胞α-ENaC的表达，对ARDS肺水肿液的清除起作用，同时也为疾病治疗提供靶点。