不明原因复发性自然流产患者HVEM基因多态性检测研究*

肖 海，娄桂予，张 倩，郭谦楠，张照婧，吴 东，张梦汀，高 越，廖世秀△

(1.河南省人民医院医学遗传研究所，郑州 450003；2.郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系 450003)

妊娠期间的胎儿和母体之间存在着复杂的免疫调节，母-胎界面调节性T细胞(Treg)优势分化，有利于妊娠的顺利进行。疱疹病毒侵入介质(herpes virus entry mediator,HVEM)基因上的一些单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点会对基因的表达或者功能造成影响，目前在很多肿瘤的研究中发现HVEM基因多态性会影响Treg的分化，进而影响疾病的发生发展[1]。目前尚无HVEM基因多态性与不明原因复发性自然流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)关系的相关报道。本文通过对河南汉族人群的HVEM基因 rs1886730和rs2234167位点进行研究，探讨HVEM基因多态性与河南汉族人群URSA的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 病例组为2017年1-12月在河南省人民医院产前诊断中心就诊的246例复发性流产女性。入选标准：自然流产大于或等于3次，排除感染、血型不合、生殖道畸形、免疫因素、内分泌异常、胚胎染色体异常等致病因素。对照组为2017年1-12月在河南诚信法医司法鉴定所进行亲子鉴定生育过1名及以上正常健康孩子且无复发性流产史的256例女性。本研究经河南省人民医院伦理委员会批准。所有研究对象知情同意后分别抽取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血2 mL。

1.2方法

1.2.1rs1886730和rs2234167位点SNP检测 采用厦门致善公司的Lab-Aid 820核酸提取Mini试剂提取样本基因组DNA，PCR扩增后利用Sanger法测序检测样本基因型。根据参考文献[1]设计引物，引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。PCR反应体系：模版DNA 1.0 μL 2×PCR，Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，去离子水9.5 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃总延伸10 min；4 ℃保存。

1.2.2基因型判读 扩增产物电泳后，切胶回收，利用Sanger测序法进行测序。测序结果与NCBI中的野生型序列进行Blast比对分析，判断位点基因型。

1.3统计学处理 应用SHEsis软件[2-3]在线分析数据，对HVEM基因rs1886730和rs2234167位点基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验，采用χ2检验比较2组间基因型频率和等位基因频率的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

2 结 果

通过Sanger测序发现246例病例组患者和256例对照组妇女HVEM基因的rs1886730位点有3种基因型，分别为CC、CT、TT，rs2234167位点有2种基因型，分别为GG和GA。河南汉族人群中HVEM基因rs2234167位点多态性与URSA无明显相关性(P>0.05)；rs1886730位点T等位基因频率在病例组和对照组间差异有统计学意义(t=14.007，P<0.01)，CT、TT基因型频率在病例组和对照组间差异有统计学意义(t=14.236，P<0.01;t=14.420，P<0.01)。见表2、3。

表2 rs1886730基因型和等位基因在病例组和对照组的分布[n(%)]

表3 rs2234167基因型和等位基因在病例组和对照组的分布[n(%)]

-：无数据

3 讨 论

自然流产是指妊娠在28周以前终止、胎儿体质量在1 000 g以下者，发生率为15%～20%[4]。复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指连续发生3次及以上自然流产的，是妊娠常见的并发症之一，发生率约为1%[5]。RSA病因极其复杂，目前已知致病因素有染色体异常、内分泌失调、生殖器官畸形、感染、环境理化等。除上述病因以外，仍有大约50%的RSA患者的致病因素不明，临床上称之为URSA[6-7]。URSA会对广大妇女的身体和心理造成巨大的伤害。由于URSA致病因素复杂多样，且发病机制尚不明确，虽然目前有很多防治手段如：中西医结合方法、免疫抑制剂、抗凝疗法、主动免疫疗法及被动免疫疗法等，但疗效均不明确。因此，探索URSA的发病机制对其防治具有十分重要的意义。

妊娠类似于同种异体移植过程，带父系抗原的胚胎不被母体免疫系统排斥，是因为胎儿与母体之间存在着复杂的免疫调节过程，通过这种相互作用建立的母-胎免疫耐受微环境保证了妊娠的顺利进行[8-9]。代孕的胎儿所携带的人类白细胞抗原系统与母体的完全不同，进一步证实了母-胎免疫耐受微环境的存在[10]。研究表明自然流产模型组Treg显著低于正常妊娠组，过继转输Treg至流产模型小鼠可改善其妊娠预后，提示Treg不但参与了母-胎免疫耐受机制的形成而且对其维持有重要作用。树突状细胞( dendritic cells,DCs)是一种抗原递呈细胞，DCs表面可表达B和T细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)[11-12]。DCs可通过与广泛表达在T细胞表面的HVEM特异性结合对T细胞起到调节作用，达到母-胎界面Treg优势分化的状态，从而有助于维持母-胎界面免疫耐受状态。BTLA/HVEM信号通路在肿瘤的T细胞抑制中发挥重要作用[13]。BTLA+DEC205+CD8+DCs可以通过BTLA/HVEM信号通路诱导Treg分化[14-15]。胚胎作为一种半同种移植物，能够不被排斥，有赖于母胎间的免疫耐受，特别是母-胎界面免疫微环境的形成和维持，这种耐受一旦被破坏，则导致病理性妊娠。基因多态性可引起蛋白结构和功能的改变，导致DCs无法通过BTLA/HVEM信号通路诱导Treg分化，即不同个体对URSA表现出不同的易感性。

有报道称rs1886730位点的基因多态性与乳腺癌的易感性相关[1]。本研究结果显示rs1886730位点CT、TT基因型在URSA组中的分布频率显著高于对照组，且T等位基因在URSA中的分布频率高于对照组，提示此位点与河南汉族人群URSA的发病有关。rs1886730位于HVEM基因内含子区域，内含子区域在转录过程中起重要作用，内含子区域发生基因突变，可能导致剪切位点的改变从而影响mRNA的二级结构，影响蛋白的功能。CT、TT基因型为河南汉族人群URSA发病的风险基因型。T等位基因为河南汉族人群URSA发病的风险等位基因。

rs2234167位于HVEM基因的外显子区域，该位点基因突变导致编码的氨基酸由缬氨酸变为异亮氨酸。有报道rs2234167位点多态性会影响HVEM的功能和表达，进而对乳腺癌的发生发展产生影响[1]。本研究结果显示病例组中的GA基因型频率和A等位基因的频率均略高于对照组，但两组数据差异无统计学意义(P>0.05)，并且本研究在河南汉族人群中未检测到AA基因型。推测该位点多态性存在种族差异，有必要扩大样本量，进一步确定该位点与URSA的关系。