金蝉花多糖对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的治疗作用及其机制研究*

2019-09-16陈盛铎王家瑞梁海莉

重庆医学 2019年16期

温萍,陈盛铎,王家瑞,车巍,郑兵,梁海莉

(湖北省中医院花园山院区肝病科,武汉 430061)

肝纤维化是因肝炎病毒、乙醇、毒素等引起免疫炎性损伤诱发的慢性渐变型疾病病理变化，以不可逆细胞外基质堆积引起肝脏组织重塑为主要病理特点[1]。临床数据显示，多种慢性肝脏疾病常在发病早期不可反转、反复刺激损伤时，最终发展成纤维化病理变化，进而引发肝功能丧失，威胁生命，而及时的干预可有效抑制纤维化的发生发展[2]。然而，目前以抗有丝分裂药物秋水仙碱为主的抗纤维化药物因为其无限制性的细胞毒作用在临床应用中受限[3]。同时，研究证实，在肝纤维化发生发展过程中，以转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)为主的由多种免疫细胞和肝细胞合成分泌的炎性相关细胞因子参与调节纤维化病程，促使炎性反应向纤维化形态转化[3-4]。且免疫调节剂在纤维化临床干预治疗中具有良好的应用前景[5]。

传统中草药金蝉花(cordyceps cicadae)中提取的金蝉花多糖(cicadas polysaccharides)具有提高机体免疫力的功能，可在体外同时激活T淋巴细胞和B淋巴细胞，并促进其增殖[6]。同时，其可有效减少肾脏细胞外基质的合成，抑制肾纤维化[7]。金蝉花多糖安全性高，对正常细胞影响小[8]，因而，金蝉花多糖在纤维化治疗中具有广阔前景。然而，目前对金蝉花多糖的作用效应及其机制尚不明确[8-9]。因此，本研究拟观察金蝉花多糖对皮下注射四氯化碳诱导小鼠急性肝纤维化的保护作用，并探讨其对Tregs的影响，为金蝉花多糖在临床应用于急性肝纤维化提供实验研究依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药物金蝉花多糖为陕西斯诺特生物技术有限公司产品，含量65%，中国药典CP2010，货号snt3688。实验前用磷酸盐缓冲液(PBS)配制成200 mg/mL溶液。秋水仙碱为西双版纳州医药有限责任公司产品，中国药典CP2010，国药准字H53021369。实验前PBS配制成0.01 mg/mL溶液。

1.1.2动物和分组无特定病原体(SPF)级C57BL/6雄性小鼠90只(华中科技大学同济医学院动物医学中心，动物许可证号SCXK20150012)，依体质量均衡分组为：正常组，模型组，秋水仙碱组(0.1 mg/kg)和金蝉花多糖低剂量(0.5 mg/kg)、中剂量(1.0 mg/kg)和高剂量(2.0 mg/kg)组，每组15只。由于四氯化碳模型毒性高，致死性高(虽然本实验中动物死亡较少)，其模型个别出现状态较差，可能致使个别四氯化碳模型小鼠在给予干预后无明显的变化，虽然总体统计有显著性差异，但动物实验差异大，因此在保证数据结果符合最初统计分析的基础上，对个别小鼠数据进行剔除，均保留10只小鼠作为最终数据展示。

1.1.3试剂四氯化碳购自德州润昕实验仪器有限公司，Masson染液购自武汉塞维尔生物技术有限公司，小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)和组织羟脯氨酸水平检测试剂盒购自天津碧云天生物技术有限公司，小鼠γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、转化生长因子-β(TGF-β)和α-肌动蛋白(α-SMA)ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，小鼠单核淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，小鼠CD4-别藻蓝蛋白(APC)和CD25-异硫氰酸荧光素(FITC)流式抗体购自北京BioLegend公司。

1.1.4仪器正置荧光显微镜和相差显微镜(日本 Olymics公司)；低温高速离心机(德国Thermo Fisher公司);C6流式细胞仪(美国BD公司)；多功能酶标仪(美国BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1模型建立与给药模型组、秋水仙碱组和金蝉花多糖组通过皮下注射四氯化碳(1.0 mg/kg)建立小鼠肝纤维化模型，每周2次，共7周。正常组同时给予橄榄油。随后，秋水仙碱组灌胃给予秋水仙碱溶液300 μL，各金蝉花多糖组灌胃均给予金蝉花多糖300 μL，2次/d，共3周。期间小鼠自由饮食。

1.2.2体质量、存活率和肝指数分析实验期间，记录小鼠体质量，分析给药前后小鼠体质量变化，并于实验结束后，处死小鼠去除肝脏，称质量后计算肝指数，公式为：肝指数=肝脏湿质量(mg)/体质量(g)。

1.2.3羟脯氨酸水平检测称取各组小鼠肝脏100 mg，加入浓盐酸后高压溶解，并用1 mol/L NaOH调节pH=7.0。采用氯胺-T法检测羟脯氨酸水平，于560 nm检测吸光度(A)值，以每克肝组织中羟脯氨酸含量表示(μg/g)。

1.2.4组织病理学检测各组小鼠肝组织置于4%多聚甲醛溶液中48 h，常规石蜡包埋并5 μm切片后，进行Masson染色。胶原沉积程度用Image-Pro Plus 6.0软件分析。

1.2.5外周血ALT、AST水平检测眼球取血800 μL于肝素钠抗凝采血管中，分取100 μL后3 000 r/min离心取血浆，吸取50 μL置于玻璃试管中，按照试剂盒说明检测血浆ALT和AST水平。

1.2.6外周血IFN-γ、IL-4和TGF-β水平检测取100 μL新鲜分离的血浆，按照ELISA试剂盒说明，检测肝组织匀浆液中IFN-γ、IL-4和TGF-β的水平。

1.2.6肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β mRNA水平检测采用TRIzol一步法提取100 mg肝组织总RNA，并使用NanoDrop2000对RNA浓度和纯度进行检测。参照逆转录试剂盒(美国Thermo fisher公司)操作步骤说明将500 ng总RNA反转录为cDNA。以TE溶液稀释cDNA至10 ng/μL，按照RT-qPCR说明，取10 ng cDNA作为反应模版，15 μL PCR反应体系，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次；72 ℃终延伸5 min。扩增结束后制作融解曲线，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，计算α-SMA、Ⅰ型胶原和TGF-β mRNA水平。引物序列:TGF-β，正向5′-AAA ATC AAG TGT GGA GCA AC-3′，反向5′-CCA CGT GGA GTT TGT TAT CT-3′，扩增产物大小 224 bp；α-SMA，正向5′-ATC TGG CAC CAC TCT TTC TA-3′，反向5′-GTA CGT CCA GAG GCA TAG AG-3′，扩增产物大小191 bp；Ⅰ型胶原，正向5′-GCT CCT CTT AGG GGC CAC T-3′，反向5′-CCA CGT CTC ACC ATT GGG G-3′，扩增产物大小103 bp；GAPDH，正向5′-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3′，反向5′-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3′，扩增产物大小123 bp。

1.2.7外周血Tregs比例分析取加入400 μL单核淋巴细胞分离液的流式管，倾斜缓慢加入400 μL抗凝血于流式管中，3 000 r/min离心取中间单核淋巴细胞层于新流式管中，PBS洗2次后，以400 μL PBS重悬，每100微升分为4管，分别加入PBS、CD4-APC、CD25-FITC和CD4-APC与CD25-FITC流式抗体各2 μL。室温避光孵育30 min，PBS洗2次后，以100 μL PBS重悬，上机检测。

2 结果

2.1金蝉花多糖对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠体质量和存活率的影响在给予四氯化碳7周时，模型组小鼠体质量明显低于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)；灌胃至10周，模型组体质量明显低于秋水仙碱组、金蝉花多糖中剂量、金蝉花多糖高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠体质量变化情况

a：P<0.05，与正常组比较；b：P<0.05，与模型组比较

A:正常组；B：模型组；C：秋水仙碱组；D：金蝉花多糖低剂量组；E：金蝉花多糖中剂量组；F：金蝉花多糖高剂量组

图1金蝉花多糖对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠肝组织形态和病理特征的影响(×100)

2.2金蝉花多糖对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠肝指数和组织重构的影响模型组肝指数明显高于正常组。通过Masson染色发现，模型组肝组织切片的蓝色胶原沉积(黑色箭头所指)面积，即纤维化比例较正常组更大，差异有统计学意义(P<0.05)。金蝉花多糖低、中、高剂量组肝指数均明显低于模型组(P<0.05)，金蝉花多糖中、高剂量组纤维化比例明显低于模型组(P<0.05)，差异有统计学意义；与秋水仙碱组相比，金蝉花多糖中、高剂量组肝指数及纤维化比例明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。