花椒黄酮提取工艺及体外抗氧化活性研究

李杰，普玲玲，王李雪，赵雨

(1.南阳理工学院 河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004；2.南阳理工学院 生化学院，河南 南阳 473004)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是一种重要的香料和药用经济作物，别名大椒、川椒或山椒，为芸香科花椒属灌木或小乔木植物花椒的干燥成熟果皮，主要产于辽宁、河南、陕西、山东、云南、四川等省份，目前已形成了山东泰安、四川茂汉、重庆江津、陕西韩城等一些全国闻名的种植基地[1-3]；值得一提的是，河南省南阳市淅川县马蹬镇近年来致力于花椒产业的发展，建成了多个万亩花椒基地，马蹬镇花椒交易市场已成为中原最大的花椒交易市场，堪称“中原花椒第一镇”。花椒中除含有挥发油、酰胺、生物碱、蛋白质、不饱和脂肪酸等多种营养成分及生物活性成分外，还富含黄酮类化合物[4-6]。研究表明，黄酮类化合物具有多种生理活性，如抑菌、抗病毒、抗衰老、防癌抗癌、增强机体免疫力等[7,8]。黄酮类化合物分子中常含有一定数量的酚羟基，在机体中可迅速将氢质子传递给自由基，终止自由基的氧化反应，表现出较强的抗氧化活性[9]。

对花椒中的黄酮类化合物进行提取，可开发成多种类型的功能食品及其他高附加值产品，有助于实现花椒资源的高值化利用，并带动种植户增收致富，促进地方经济的发展。

黄酮类化合物的提取主要有溶剂浸提法、回流法、超声波法、微波法等，其中，溶剂浸提法操作简单、成本较低，易于实现工业化生产。但在具体提取操作时，影响其得率的因素较多，且因素与得率之间存在着复杂的非线性关系，采用常规方法对提取工艺进行优化时，需进行大量实验，并需采用多元回归的方法建立回归方程拟合实验数据，对回归方程进行寻优求解从而确定最优提取工艺，使用时非常不便；当前，人工智能领域的相关理论及实践快速发展，为有效解决实验和生产过程中面临的非线性系统的建模与优化问题提供了新的途径。

人工神经网络是通过计算机模拟生物大脑神经网络结构和功能而建立的信息处理系统，特别是基于误差反向传播算法的BP神经网络对于具有复杂非线性关系的数据有较强的学习能力，在具有非线性关系的多因子试验的建模与系统优化方面应用广泛[10]。但BP神经网络主要是通过调节输入层、隐含层及输出层神经元之间的权值和阈值对数据进行拟合，故不存在具体的数学表达式，无法通过传统的优化方法对其进行求解[11,12]。而遗传算法是借鉴进化生物学中的自然选择和遗传进化原理的优化搜索算法，核心思想是将待求解问题的可行解进行编码表示成染色体，然后按照选择、交叉和变异操作生成初始种群，并根据适应度值大小筛选出一定数量优秀染色体，反复进行选择、交叉、变异的迭代操作，直至获得适应度值最大的染色体，对染色体进行解码即可得最优解[13,14]。

本文旨在Box-Behnken试验基础上，在有限学习样本约束条件下，通过BP神经网络的学习、训练，拟合试验数据得到网络模型，再与遗传算法结合优化花椒黄酮提取工艺条件，并制备花椒黄酮提取液；同时考察花椒黄酮提取液对·OH、DPPH·及ABTS+·的清除能力，评价其体外抗氧化活性，以期为花椒资源综合开发利用提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

花椒：南阳淅川县马蹬镇邢沟花椒基地。

1.1.2 试剂

芦丁：中国药品生物制品检定所；DPPH、ABTS二铵盐：上海北诺生物科技有限公司；石油醚(60～90 ℃)、无水乙醇、氯仿、正丁醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、盐酸、双氧水、硫酸亚铁、抗坏血酸、过硫酸钾、水杨酸等：均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

JJ-2植物粉碎机 北京维欣仪奥科技发展有限公司；Q/OANN 10-2008电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；CS101-1电热鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；HZQ-X300C恒温振荡器 上海一恒科学仪器有限公司；TDL-4A 台式离心机 上海继锦化学科技有限公司；UV757紫外分光光度计 郑州南北仪器设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线绘制

精密称取于105 ℃烘箱烘至恒重的芦丁标准样品15.0 mg，用50%乙醇进行溶解并定容至100 mL，配成浓度为0.15 mg/mL的标准溶液。分别吸取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL标准溶液置于7个10 mL刻度试管中，再分别向刻度试管中加入2 mL 50%乙醇、0.5 mL 5% NaNO2，振荡摇匀后静置5 min，再分别加入0.5 mL 10% Al(NO3)3，振荡摇匀后静置5 min，最后分别加入3.0 mL 10% NaOH，震荡均匀后用50%乙醇定容至刻度，静置10 min，于507 nm波长处测定吸光度。以芦丁含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，见图1。标准曲线回归方程为 y=0.3395x+0.0078(y为吸光度，x为芦丁标准品的质量浓度)，相关系数R2=0.9975。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

1.2.2 花椒黄酮提取液的制备及得率计算

花椒粉碎后称取适量用滤纸包好，细棉线扎紧，置于索氏提取器中，加入石油醚回流脱脂3 h，取出滤纸包，置于电热鼓风干燥箱中低温烘干石油醚，备用。用不同体积分数的乙醇作提取剂，在不同试验条件下浸提，提取液于3000 r/min离心15 min，上清液加入Sevage试剂(正丁醇∶氯仿为1∶5，V/V)剧烈震荡5 min脱蛋白，分液漏斗静置20 min后分离除去蛋白层，重复脱蛋白5次得花椒黄酮提取液。

吸取适量花椒黄酮提取液，参考1.2.1的方法于507 nm 波长下测吸光度，与芦丁标准曲线进行对照，得出提取液中花椒黄酮的含量，计算花椒黄酮得率。

花椒黄酮得率(mg/g)=C×V/m。

式中：C为花椒黄酮提取液浓度(mg/mL)；V为花椒黄酮提取液体积(mL)；m为花椒原料质量(g)。

1.2.3 单因素试验设计

分别称取经粉碎及脱脂处理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法进行震荡提取(震荡速率110 r/min)，并制备花椒黄酮提取液，分别考察乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、提取时间(30，60，90，120，150 min)、提取温度(40，50，60，70，80 ℃)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g/mL)等因素对花椒黄酮得率的影响。

1.2.4 Box-Behnken试验设计

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[15]，以花椒黄酮得率为响应值，选取对花椒黄酮得率影响较大的乙醇体积分数(A)、提取时间(B)、提取温度(C)、料液比(D)作为响应因子，采用Design-Expert 8.06软件进行四因素三水平的Box-Behnken试验设计，试验因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5 BP神经网络模型的建立

将Box-Behnken试验中的考察因素作为BP神经网络的输入层，输入层设计4个神经元，分别代表乙醇体积分数、提取时间、提取温度及料液比；将响应值作为输出层，输出层设计1个神经元，代表花椒黄酮得率；设置不同的隐含层神经元个数并进行多次拟合比较，确定隐含层神经元数量为8个；利用Matlab软件编写程序，建立BP神经网络[16]。

1.2.6 遗传算法优化求解

将训练后BP神经网络的预测结果(花椒黄酮得率)作为遗传算法的个体适应度函数值，根据适应度值的大小，从每代个体中选出优秀的个体，反复进行选择、交叉、变异的迭代运算，直至获得适应度值最大(花椒黄酮得率最大)的个体，解码即可得相应参数(乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比)的实际值[17]。

1.2.7 花椒黄酮抗氧化活性评价

根据试验确定的最优条件进行花椒黄酮提取液的制备，提取液经旋转蒸发仪浓缩至0.6120 mg/mL后，采用倍比稀释的方法得到一系列具有不同浓度梯度(0.6120，0.3060，0.1530，0.0765，0.0383，0.0191，0.0096，0.0048，0.0024，0.0012 mg/mL)的花椒黄酮提取液备用。

1.2.7.1 清除·OH活性测定

采用文献[18,19]的方法稍微修改，向已清洗干净的10支具塞刻度试管中分别加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，再分别向每支试管中加入事先制备的具有一系列浓度梯度的花椒黄酮提取液2 mL和6 mmol/L的H2O2溶液2 mL，采用漩涡振荡器混匀，室温静置10 min后加入6 mmol/L的水杨酸醇溶液2 mL，采用漩涡振荡器混匀后置于37 ℃水浴条件下反应30 min，作为待测样品；用相同体积的蒸馏水替代H2O2溶液作为对照组；用相同体积的蒸馏水替代花椒黄酮提取液作为空白组；用与花椒黄酮提取液浓度相同的Vc溶液作为阳性对照；以蒸馏水调零，在510 nm波长下分别测定样品组、对照组、空白组及阳性对照组的吸光度，通过下式计算花椒黄酮提取液及与花椒黄酮提取液同浓度的Vc溶液对·OH的清除率，计算花椒黄酮提取液、Vc溶液的IC50值(自由基清除率为 50%时的浓度)。

1.2.7.2 清除DPPH·活性测定

采用文献[20]的方法稍微修改，准确配制0.5 mmol/L的DPPH乙醇溶液，向已清洗干净的10支具塞刻度试管中分别加入2 mL已配制好的DPPH乙醇溶液、2 mL无水乙醇，再分别向试管中加入事先制备的具有一系列浓度梯度的花椒黄酮提取液2 mL，采用漩涡振荡器混匀，在避光的条件下于25 ℃静置30 min，作为待测样品；用相同体积的无水乙醇替代DPPH溶液作为对照组；用相同体积的蒸馏水替代花椒黄酮提取液作为空白组；用与花椒黄酮提取液浓度相同的Vc溶液作为阳性对照；以无水乙醇调零，在517 nm波长下分别测定样品组、对照组、空白组及阳性对照组的吸光度，通过下式计算花椒黄酮提取液及与花椒黄酮提取液同浓度的Vc溶液对DPPH·的清除率，计算花椒黄酮提取液、Vc溶液的IC50值。

1.2.7.3 清除ABTS+·活性测定

采用文献[21,22]的方法稍微修改，ABTS+·储备液的配制：将7.4 mmol/L的ABTS二铵盐溶液和2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液以同样的体积混合均匀，在25 ℃下置于暗处避光反应16 h。ABTS+·工作液的配制：吸取1 mL ABTS+·储备液用无水乙醇进行稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02，ABTS+·工作液需现配现用。向已清洗干净的10支具塞刻度试管中分别加入1.5 mL的ABTS+·工作液，再分别向试管中加入事先制备的具有一系列浓度梯度的花椒黄酮提取液0.5 mL，采用漩涡振荡器混匀，在避光的条件下于25 ℃静置10 min，作为待测样品；用相同体积的蒸馏水替代ABTS+·工作液作为对照组；用相同体积的蒸馏水替代花椒黄酮提取液作为空白组；用与花椒黄酮提取液浓度相同的Vc溶液作为阳性对照；以蒸馏水调零，在734 nm波长下分别测定样品组、对照组、空白组及阳性对照组的吸光度，通过下式计算花椒黄酮提取液及与花椒黄酮提取液同浓度的Vc溶液对ABTS+·的清除率，计算花椒黄酮提取液、Vc溶液的IC50值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对花椒黄酮得率的影响

分别称取经粉碎及脱脂处理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法进行震荡提取(震荡速率110 r/min)，制备花椒黄酮提取液，考察乙醇体积分数对花椒黄酮得率的影响，结果见图2。

图2 乙醇体积分数对花椒黄酮得率的影响Fig.2 The effect of ethanol volume fraction on yield of Zanthoxylum bungeanum flavonoids

由图2可知，乙醇体积分数为40%～60%时，随着乙醇体积分数的增大，花椒黄酮得率逐渐增加，可能是在提取剂作用下花椒细胞组织发生溶胀，易于黄酮类化合物的溶出；当乙醇体积分数大于60%时，随着乙醇体积分数的增大，花椒黄酮得率逐渐降低，可能是由于提取剂极性下降，使得一部分脂溶性化合物溶出，导致花椒黄酮得率下降。

2.1.2 提取时间对花椒黄酮得率的影响

分别称取经粉碎及脱脂处理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法进行震荡提取(震荡速率110 r/min)，制备花椒黄酮提取液，考察提取时间对花椒黄酮得率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对花椒黄酮得率的影响Fig.3 The effect of extraction time on yield ofZanthoxylum bungeanum flavonoids

由图3可知，提取时间为30～90 min时，花椒黄酮得率随着提取时间的增加逐渐增大；提取时间为90～150 min时，随着提取时间的增加，花椒黄酮得率逐渐降低，可能是由于提取时间过长，部分花椒黄酮长时间受热发生分解，导致得率下降。

2.1.3 提取温度对花椒黄酮得率的影响

分别称取经粉碎及脱脂处理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法进行震荡提取(震荡速率110 r/min)，制备花椒黄酮提取液，考察提取温度对花椒黄酮得率的影响，结果见图4。

图4 提取温度对花椒黄酮得率的影响Fig.4 The effect of extraction temperature on yield ofZanthoxylum bungeanum flavonoids

由图4可知，提取温度在40～60 ℃范围时，随着提取温度的增加，花椒黄酮得率逐渐增大；提取温度超过60 ℃时，若提取温度继续增加，则花椒黄酮得率逐渐降低，可能是温度过高，花椒黄酮过度受热，苷元结构被破坏，导致得率降低。

2.1.4 料液比对花椒黄酮得率的影响

分别称取经粉碎及脱脂处理的花椒原料2.0 g，按照1.2.2的方法进行震荡提取(震荡速率110 r/min)，制备花椒黄酮提取液，考察料液比对花椒黄酮得率的影响，结果见图5。

图5 料液比对花椒黄酮得率的影响Fig.5 The effect of solid-liquid ratio on yield ofZanthoxylum bungeanum flavonoids

由图5可知，料液比小于1∶25(g/mL)时，随着料液比的增加，花椒黄酮得率呈增加趋势；料液比大于1∶25(g/mL)时，随着提取剂用量的增加，黄酮得率逐渐下降。可能是由于料液比为1∶25(g/mL)时，花椒黄酮已基本溶出，若继续增加提取剂用量，不利于花椒组织细胞层面的传质传热，其他醇溶性化合物也会与花椒黄酮相互竞争提取剂，使得黄酮得率降低。

2.2 BP神经网络模型建立

根据1.2.4 试验设计方案，采用Design-Expert 8.06软件进行四因素三水平的Box-Behnken试验设计，试验方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken试验方案与结果Table 2 The schedule and results of Box-Behnken experiment

续 表

随机从Box-Behnken试验结果中选取24组数据作为BP神经网络的学习及训练样本，剩余的3组数据作为检验样本，BP神经网络隐含层的传递函数采用“tansig”，输出层的传递函数采用“purelin”，BP神经网络的学习及训练采用“trainlm”算法，训练前使用“mapminmax”命令对数据进行归一化处理；采用训练误差平方和(mse)评估模型的性能，mse达到10-3停止训练。BP神经网络学习及训练过程见图6，试验值与预测值对比见图7。

图6 BP神经网络学习及训练过程Fig.6 The learning and training process of BP neural network

图7 试验值与BP神经网络预测值的对比Fig.7 The comparison between experimental values and predictive values of BP neural network

由图6可知，经过7544次学习及训练，BP神经网络的mse达到10-3，神经网络收敛，结束训练。由图7可知，3个测试样本在各自试验条件下的试验值分别为13.10，13.19，16.57 mg/g，经学习及训练后的BP神经网络在与测试样本相同条件下的输出值(即预测值)分别为13.1421，13.2294，16.5458 mg/g，输出值和测试样本之间的误差较小，说明经学习及训练后的BP神经网络模型具有良好的预测性和准确性，能够反映乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比与花椒黄酮得率之间的非线性关系，可利用遗传算法对其进行全局搜索优化求得极值，从而确定花椒黄酮最优的提取工艺条件。

2.3 遗传算法优化求解结果

根据1.2.6的方法对BP神经网络进行优化求解，遗传算法寻优初始种群规模27，初始种群个体输入参数范围分别为乙醇体积分数[50，70]、提取时间[60，120]、提取温度[50，70]、料液比[20，30]；采用单点交叉，概率0.5，变异概率0.02，遗传进化200代。种群适应度值(花椒黄酮得率)迭代变化曲线见图8。

图8 遗传算法寻优过程Fig.8 The optimizing computation process of genetic algorithm

由图8可知，种群迭代进化80代以后，种群适应度值的变化逐渐平缓，迭代进化100代后趋于稳定。运行程序进行求解可得，BP神经网络最优适应度值(花椒黄酮得率)为19.6837 mg/g，对应的各参数值为：乙醇体积分数56.8310%，提取时间93.5554 min，提取温度62.5623 ℃，料液比1∶27.7673(g/mL)。为便于实际操作，将各参数值进行适当修正，结果为：乙醇体积分数57%，提取时间94 min，提取温度63 ℃，料液比1∶28(g/mL)。

2.4 最优提取工艺的验证

根据BP神经网络和遗传算法优化求解修正后的花椒黄酮提取工艺参数，进行3次验证实验，并取平均值，结果花椒黄酮得率为19.7273 mg/g，变异系数CV(SD/Mean×100%)为2.15%，说明结果可信度较高，且与理论预测值相差不大，故确定花椒黄酮最优提取工艺为：乙醇体积分数57%，提取时间94 min，提取温度63 ℃，料液比1∶28(g/mL)。

2.5 花椒黄酮体外抗氧化活性评价结果

2.5.1 花椒黄酮提取液对·OH的清除作用

根据1.2.7.1的方法对花椒黄酮提取液清除·OH的活性进行测定，结果见图9。

由图9可知，当浓度小于0.0765 mg/mL时，花椒黄酮提取液和Vc溶液对·OH的清除力随浓度的增加而迅速增大，两者清除·OH的能力相差不大；当浓度大于0.0765 mg/mL时，随浓度的增大，花椒黄酮提取液和Vc溶液对·OH清除力增加趋势变缓，但高浓度条件下，Vc溶液比花椒黄酮提取液清除·OH的能力更强。花椒黄酮提取液清除·OH的IC50为0.0371 mg/mL，Vc溶液清除·OH的IC50为0.0239 mg/L，说明花椒黄酮提取液对·OH有较好的清除效果。

图9 花椒黄酮提取液对·OH的清除效果Fig.9 The scavenging effect of Zanthoxylum bungeanum flavonoids extraction solution on ·OH

2.5.2 花椒黄酮提取液对DPPH·的清除作用

根据1.2.7.2的方法对花椒黄酮提取液清除DPPH·的活性进行测定，结果见图10。

图10 花椒黄酮提取液对DPPH·的清除效果Fig.10 The scavenging effect of Zanthoxylum bungeanum flavonoids extraction solution on DPPH·

由图10可知，花椒黄酮提取液和Vc溶液对DPPH·的清除率随浓度的增加而增大，但花椒黄酮提取液对DPPH·的清除能力显著弱于Vc溶液。花椒黄酮提取液清除DPPH·的IC50为0.0829 mg/mL，Vc溶液清除DPPH·的IC50为0.0305 mg/mL，花椒黄酮提取液和Vc溶液均表现出较强的清除DPPH·能力。

2.5.3 花椒黄酮提取液对ABTS+·的清除作用

根据1.2.7.3的方法对花椒黄酮提取液清除ABTS+·的活性进行测定，结果见图11。

由图11可知，浓度在0～0.0191 mg/mL时，花椒黄酮提取液和Vc溶液对ABTS+·的清除率近乎呈直线上升；浓度在0.0191～0.1530 mg/mL时，两者对ABTS+·的清除率增加缓慢；浓度在0.1530～0.6120 mg/mL时，两者对ABTS+·的清除率增加趋于平缓。花椒黄酮提取液清除ABTS+·的IC50为0.0175 mg/mL，Vc清除ABTS+·的IC50为0.0109 mg/mL，说明花椒黄酮提取液具有很好的清除ABTS+·自由基活性。

图11 花椒黄酮提取液对ABTS+·的清除效果Fig.11 The scavenging effect of Zanthoxylum bungeanum flavonoids extraction solution on ABTS+·

3 结论

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验的因素水平和响应值，采用BP神经网络对影响花椒黄酮提取得率的4个主要因素与得率之间的非线性关系进行了拟合建模，经学习及训练后的BP神经网络模型具有良好的预测性和准确性，能够反映乙醇浓度、提取时间、提取温度、料液比和花椒黄酮得率之间的非线性关系，可利用遗传算法对其进行全局搜索优化求得极值，从而确定花椒黄酮最优的提取工艺条件。

将BP神经网络和遗传算法相结合，精确求得了影响花椒黄酮提取得率的4个主要因素的最佳水平，并进行验证，从而确定了花椒黄酮最优提取工艺为：乙醇体积分数57%，提取时间94 min，提取温度63 ℃，料液比1∶28(g/mL)。

体外抗氧化活性试验结果表明，花椒黄酮提取液具有较强的清除·OH、DPPH·及ABTS+·活性，其清除自由基的能力与花椒黄酮提取液浓度有明显的量效关系。

综上所述，本文基于花椒黄酮提取过程中提取工艺参数与得率之间存在的非线性关系，利用Box-Behnken试验的数据，通过Matlab软件编程，建立了能够反映主要提取工艺参数与黄酮得率之间非线性关系的BP神经网络模型，且经学习及训练后的BP神经网络模型具有良好的预测性和准确性，并通过遗传算法，实现了花椒黄酮提取工艺参数与得率的同步寻优求解，为试验研究及生产实践中面临的具有非线性关系的多目标同步优化问题提供了一种新的解决方案；花椒黄酮提取液体外抗氧化活性试验结果表明，花椒黄酮具有显著的自由基清除能力和抗氧化活性，其清除自由基的能力与花椒黄酮提取液浓度有明显的量效关系。花椒黄酮作为一种天然的抗氧化剂，值得深入研究和开发，试验结果为南阳淅川县马蹬镇花椒资源的综合开发利用提供了有价值的参考。