外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片生理特性的影响

刘建新，欧晓彬，王金成

(甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室/陇东学院生命科学与技术学院，甘肃 庆阳 745000)

裸燕麦(AvenanudaL.)是我国丘陵沟壑旱作区栽培的一种杂粮作物，具有喜阴凉、耐盐抗旱等生物学特性，主要分布在西南、西北、华北等地区的高海拔冷凉地带，年种植面积约55万hm2[1]。裸燕麦籽粒不仅蛋白质、脂肪和β-葡聚糖等营养成分高，而且还具有控制血糖、血压和血脂升高的保健功效[2]。然而，裸燕麦种植区多属于干旱半干旱少雨地区，干旱胁迫成为其生长发育和产量提高的重要限制因子。干旱胁迫下，裸燕麦叶片光合速率下降[3]，活性氧(Reactive oxygen species, ROS)积累导致膜脂过氧化[4]，植株生长发育受阻和产量下降[5]。因此，探索提高裸燕麦抗旱性的技术途径，对减轻裸燕麦旱灾伤害具有重要意义。

过氧化氢(H2O2)是植物体中一种重要的信号分子，它参与植物防御系统对逆境响应的调控，能够增强植物对环境胁迫的耐性[6]。研究表明，H2O2参与了脱落酸诱导的拟南芥(Arabidopsisthaliana)气孔关闭过程[7]，外施H2O2能够缓解干旱胁迫诱导的活性氧积累对黄瓜叶绿体膜的伤害[8]，提高玉米植株对盐胁迫的耐性[9]，增强葡萄对低温[10]和水稻对镉胁迫[11]的适应能力。外源H2O2在燕麦上也有影响种子活力和提高耐盐性、耐碱性的报道。夏方山等[12]研究表明，高浓度H2O2(3.84 mol·L-1)处理会导致燕麦种子活力的丧失。低浓度(0. 5 mmol·L-1) H2O2则可缓解盐碱混合胁迫对燕麦种子萌发和成苗的抑制，且这一过程有Ca2+参与[13]。根部浇灌和叶面喷施H2O2均可通过调控活性氧代谢和渗透溶质积累以及维持K+、Na+平衡，增强燕麦幼苗的耐盐性[14-15]。外施H2O2通过促进脯氨酸合成和抑制其降解提高了盐碱混合胁迫下燕麦幼苗脯氨酸的含量[16]。碱胁迫下外源H2O2能够增强燕麦幼苗的活性氧清除能力，提高渗透调节物质含量，缓解植株生长的受抑制程度[17-18]。渗透胁迫下膜脂过氧化伤害和光合作用受抑是植物普遍的生理响应[3-5，8，14-18]。外施H2O2能够调控活性氧代谢，缓解盐碱胁迫对燕麦幼苗的氧化伤害[14-18]，且H2O2参与脱落酸诱导的植物气孔关闭过程[7]。那么，外源H2O2能否通过对受旱燕麦生理响应的调节，提高燕麦幼苗的抗旱性，目前尚未见研究报道。本试验以白燕7号裸燕麦品种为材料，研究了幼苗叶片光合特性、活性氧代谢和渗透溶质积累等生理特性的变化，探讨外源H2O2预处理对干旱胁迫下裸燕麦幼苗生理响应的调控机制，旨在为应用H2O2增强裸燕麦耐旱性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 化学试剂和材料培养

试验于2016年4-7月在甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室日光温室进行。供试30% H2O2为美国Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。裸燕麦品种为白燕7号，种子购自吉林省白城市农业科学研究院。将裸燕麦种子在培养箱中25 ℃催芽后选发芽一致的幼苗播种在盛满珍珠岩的塑料盆(口径20 cm，高14 cm)中，置于日光温室培养，昼温22～32℃，夜温16～20℃，相对湿度65%±5%，光照强度400～610 μmol·m-2·s-1，常规管理。待幼苗二叶一心期时每盆选留长势一致的壮苗约200株，并浇灌1次1/2 Hoagland营养液300 mL，幼苗长至三叶一心期时进行试验处理。

1.2 试验设计

1.2.1 预试验筛选聚乙二醇6000(PEG)和H2O2处理浓度 干旱胁迫：分别用含有PEG 0.0%、11.9%、14.9%、17.8%和20.2%的Hoagland溶液(渗透势分别为0.0、0.2、0.3、0.4、0.5 MPa)根部浇灌三叶一心期裸燕麦幼苗模拟干旱胁迫，浇灌于每天8∶00进行一次，浇灌量250 mL。H2O2预处理：分别用浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、5 mmol·L-1H2O2溶液(加2滴吐温-80以降低表面张力)对三叶一心期裸燕麦幼苗进行叶面喷施，每盆幼苗喷施量约10 mL，待叶片吸收H2O212 h后用含17.8% PEG的Hoagland溶液根部浇灌模拟干旱处理。以上处理每盆作为1个重复，3次重复，随机排列。干旱胁迫4 d后测定每盆10株幼苗倒数第2～3片叶的净光合速率(Pn)，每盆取0.50 g倒数第2～3片叶测定丙二醛(MDA)含量，测定重复3次。

1.2.2 H2O2和PEG交叉试验处理 根据预试验筛选的PEG和H2O2浓度，设置如下4个处理：CK，蒸馏水喷施三叶一心期裸燕麦幼苗地上部12 h后根部浇灌Hoagland营养液；H2O2处理，用0.01 mmol·L-1H2O2喷施三叶一心期裸燕麦幼苗地上部12 h后根部浇灌Hoagland营养液；PEG处理，用蒸馏水喷施三叶一心期裸燕麦幼苗地上部12 h后根部浇灌含17.8% PEG的Hoagland营养液；H2O2+PEG处理，用0.01 mmol·L-1H2O2喷施三叶一心期裸燕麦幼苗地上部12 h后根部浇灌含17.8% PEG的Hoagland营养液。喷施液中加2滴吐温-80来降低叶片表面张力，喷施于20∶00进行，喷至叶面滴液为限，喷施量每盆约10 mL。根部浇灌于每天8∶00进行一次，浇灌量250 mL。每个处理8盆，随机排列。根部浇灌处理4 d后取幼苗从上向下数第2～3片叶测定各项生理指标。细胞膜相对透性和光合参数取鲜叶直接测定，其它生理指标测定用液氮速冻后-70℃低温冰箱保存材料。根部浇灌处理12 d后处理间植株表型差异明显，测定植株生长指标。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 光合色素含量和光合参数 叶片光合色素含量采用高俊凤[19]的方法测定。试验结束当天上午(晴)9∶00-11∶00用CIRAS-2光合仪(美国PP Systems公司)测定幼苗叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。采用开放式气路，红蓝光源叶室，设定光合有效辐射为1 000 μmol·m-2·s-1，CO2浓度为400 μmol·mol-1，根据测定结果计算光合水分利用率WUE=Pn/Tr。

1.3.3 渗透调节物质含量 分别采用李合生[22]的蒽酮比色法、考马斯亮蓝法、茚三酮染色法和磺基水杨酸法测定幼苗叶片中可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸和脯氨酸含量。

1.3.4 植株生长和相对含水量 干旱胁迫12 d后取50株幼苗用直尺测量株高和根长，100株幼苗用自来水冲洗干净后吸干表面水分称鲜重，然后在烘箱中105℃杀青30 min，70℃烘干至恒重，称干重。取20株幼苗采用高俊凤[19]的方法测定植株相对含水量。

1.4 数据统计分析

所有指标测定重复3次，结果计算均以单位材料鲜重为基础，结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 20.0进行单因素方差分析和Duncan法多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 PEG和H2O2处理浓度的确定

与CK相比，11.9% PEG处理裸燕麦幼苗4 d后叶片Pn和MDA含量无显著变化(图1)，而14.9%～20.2% PEG处理下Pn显著下降，MDA含量显著升高，其中17.8% PEG处理的Pn和14.9% PEG处理的Pn差异不显著，但MDA含量显著提高。另外从幼苗表型观察，11.9%～17.8% PEG处理的幼苗仍保持绿色，而20.2% PEG处理的幼苗萎蔫严重，部分植株叶尖发黄。因此，本试验选用17.8% PEG作为干旱胁迫的浓度。以 0、0.001、0.01、0.1、1、5 mmol·L-1H2O2喷施预处理裸燕麦幼苗12 h后根部浇灌17.8% PEG处理4 d，0.01和0.1 mmol·L-1H2O2处理的裸燕麦幼苗叶片Pn显著高于0 mmol·L-1H2O2的对照(CK)，且两者的Pn差异不显著，而两者的MDA含量显著低于CK，其中0.01 mmol·L-1H2O2处理降低MDA含量的作用更加明显；≥1 mmol· L-1H2O2处理的Pn显著低于CK，MDA含量显著高于CK(图2)。因此，H2O2浓度选用0.01 mmol·L-1。

2.2 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片光合色素含量的影响

由表1可知，与CK 相比，干旱胁迫显著降低了裸燕麦幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、类胡萝卜素含量及叶绿素a/b值。外源H2O2显著提高了干旱胁迫下幼苗叶片的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、类胡萝卜素含量及叶绿素a/b值，H2O2+ PEG处理的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、类胡萝卜素含量及叶绿素a/b值比PEG处理分别提高了20.0%、12.9%、18.5%、8.1%和24.3%。单独H2O2处理的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素(a+b)、类胡萝卜素含量及叶绿素a/b值与CK无显著差异。

注：不同字母表示处理间在P<0.05水平差异显著，下同。 Note: Different letters indicates significant difference at P<0.05 level, the same below.图1 不同浓度PEG处理对裸燕麦幼苗叶片净光合速率和丙二醛含量的影响Fig.1 Effects of different concentrations of PEG on net photosynthetic rate and malondialdehyde (MDA) content in leaves of naked oat seedlings

图2 不同浓度H2O2对PEG(17.8%)模拟干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片净光合速率和丙二醛含量的影响Fig.2 Effects of different concentrations of H2O2 on net photosynthetic rate and MDA content in leaves of naked oat seedlings under PEG (17.8%) drought stress

处理Treatment叶绿素aChlorophyll a叶绿素bChlorophyll b叶绿素(a+b)Chlorophyll (a+b)叶绿素a/bChlorophyll a/b类胡萝卜素CarotenoidCK1.937±0.008a0.533±0.002a2.470±0.006a3.634±0.028b0.425±0.012aH2O21.950±0.028a0.534±0.005a2.484±0.033a3.651±0.023b0.419±0.006aPEG1.265±0.004c0.366±0.005c1.632±0.007c3.454±0.037c0.251±0.007cH2O2+PEG1.581±0.003b0.421±0.005b2.002±0.006b3.758±0.041a0.331±0.013b

注：同列不同字母表示处理间在P<0.05水平差异显著，下同。

Note: Values followed by different letter within a column are significantly different among treatments atP<0.05 based on the SSR test. The same below.

2.3 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片光合参数的影响

从表2可见，与CK相比，干旱胁迫下裸燕麦叶片Pn、Gs和Tr显著降低，降幅分别为32.9%、41.3%和37.8%;Ci提高13.7%,差异显著；WUE略有提高，但差异不显著。外施H2O2处理显著提高了干旱胁迫下的Pn、Gs和Ci，增幅分别为20.6%、25.9%和12.0%，Tr降低9.7%，WUE升高33.8%。单一H2O2处理与CK相比除Gs明显降低外，对Pn、Tr、Ci和WUE无显著影响。

2.4 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片活性氧产生和膜脂过氧化的影响

2.5 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片抗氧化防御系统的影响

表4表明，与CK相比，PEG处理的裸燕麦幼苗叶片SOD和POD活性分别提高了93.0%和30.6%，CAT、APX活性和GSH含量分别降低了57.8%、57.6%和24.7%，ASA含量变化不大； H2O2+ PEG处理与PEG处理相比，SOD、POD活性分别下降了21.5%和60.4%，CAT、APX活性和ASA含量分别提高了113.5%、102.9%和13.8%，差异均达显著水平，而GSH含量没有显著差异。单一H2O2处理与CK相比，显著降低了CAT、POD和APX活性及GSH含量，降幅分别为19.6%、27.2%、27.8%和35.4%，ASA含量提高了9.4%，差异达显著水平，SOD活性则变化不大。

2.6 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

由表5可知，与CK相比，PEG处理下裸燕麦幼苗叶片可溶性蛋白质含量降低了16.1%，而可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量分别提高了79.9%、51.0%和23.9%。 H2O2+ PEG处理与PEG处理相比，可溶性蛋白质、可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量分别提高了10.5%、40.3%、13.8%和17.2%，差异显著。单一H2O2处理的可溶性蛋白质和可溶性糖含量与CK差异不显著，游离氨基酸和脯氨酸含量分别提高了34.9%和29.5%。

表2 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片光合气体交换参数的影响

表3 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片丙二醛含量和细胞膜相对透性的影响

表4 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片中抗氧化防御系统的影响

表5 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

2.7 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗生长和植株相对含水量的影响

表6表明，PEG处理与CK相比，裸燕麦幼苗株高、根长、鲜重、干重和相对含水量分别降低了23.8%、27.7%、30.6%、26.1%和17.0%。与PEG处理相比， H2O2+ PEG处理的裸燕麦幼苗株高、根长、鲜重、干重和相对含水量分别提高了14.8%、25.0%、20.1%、11.0%和5.93 %，差异显著。单一H2O2处理的上述指标与CK相比均无显著差异。

3 讨 论

3.1 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗活性氧代谢的影响

表6 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗生长和植株相对含水量的影响

3.2 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗渗透调节物质含量的影响

积累可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质是燕麦适应干旱胁迫的重要特征[4]。张波等[29]研究表明，外源H2O2能够提高盐胁迫下叶片可溶性糖和GSH含量，从而增强小麦幼苗耐盐性。本研究结果显示，PEG模拟的干旱胁迫下裸燕麦幼苗主要通过增加可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸积累来加强渗透调节，外源H2O2能够提高干旱胁迫下裸燕麦叶片的可溶性蛋白质、可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量。这与外源H2O2可提高NaCl胁迫下燕麦叶片可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸含量的结果一致[15]。表明外源H2O2能够通过提高幼苗叶片的可溶性蛋白质、可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量来增强受旱裸燕麦的渗透调节能力。外源H2O2提高干旱胁迫裸燕麦幼苗游离氨基酸和可溶性蛋白质含量的原因一方面可能与H2O2能够增强逆境下胁迫蛋白[26]和抗氧化酶基因表达[10，27]有关；另一方面可能是H2O2作为胁迫信号介导外源水杨酸促进了干旱胁迫下幼苗对氮素的吸收与同化，从而提高了总氮、游离氨基酸和可溶性蛋白质的积累[30]。H2O2能够提高干旱胁迫下裸燕麦可溶性糖含量可能是因为H2O2提高了抗氧化防护后有效保护了干旱诱导的活性氧对细胞膜系统的伤害，从而提高了光合色素含量(表1)和光合速率(表2)，使糖类物质得到积累。脯氨酸不仅是细胞内重要的渗透调节物质，还具有稳定细胞膜系统和生物大分子及降低细胞酸性和清除活性氧的功能，脯氨酸水平的高低通常与细胞承受的胁迫程度呈正相关[31]。外源H2O2提高受旱裸燕麦叶片脯氨酸含量的原因可能与H2O2能够激活鸟氨酸-δ-氨基转移酶和Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶活性，抑制脯氨酸脱氢酶活性有关[16]。

3.3 外源H2O2对干旱胁迫下裸燕麦幼苗光合作用和植株生长的影响

干旱胁迫下，植物水分代谢失调导致叶绿体膜结构遭到破坏[8]，叶绿素含量和光合速率降低[3]，植株生长受到抑制[5]。邱宗波等[32]研究发现，激光预处理可通过诱导内源H2O2产生提高受旱小麦光合色素含量和促进植株生长发育。廖伟彪等报道[33]，外源H2O2可提高3种萱草(Hemerocallis)的叶片相对含水量和气孔密度，降低气孔开度。Feng等[34]认为内源H2O2通过提高叶片的抗氧化能力增强了小麦的抗旱性，而Ishibashi等[35]得出喷施H2O2提高干旱胁迫下大豆叶片含水量是由H2O2促进低聚糖生物合成而非气孔快速关闭所致。本研究表明，外源H2O2可以缓解干旱胁迫下裸燕麦叶片光合色素含量的降幅，并提高叶绿素a/b和类胡萝卜素含量。叶绿素a/b反映类囊体的垛叠程度，垛叠程度越高，光抑制作用越弱；类胡萝卜素具有提高光合效率、吸收剩余光能和清除活性氧的作用[36]。推测外源H2O2有助于保护受旱裸燕麦叶绿体膜结构的稳定性，这与外源H2O2通过提高抗氧化酶活性保护干旱胁迫下黄瓜叶绿体超微结构的结果一致[8]。叶绿体膜结构稳定性的维持使干旱胁迫下裸燕麦幼苗光能吸收和转化效率提高，从而有效提高了叶片的Pn。Pn的提高会增强植株光合产物的积累，促进植株生长。外源H2O2显著促进干旱胁迫下裸燕麦植株生长和生物量积累(表6)表明，外源H2O2能够增强裸燕麦幼苗的耐旱性。

干旱胁迫通过气孔和非气孔因素使光合作用受到抑制，前者Ci下降，后者Ci提高[37]。本研究中，干旱胁迫导致裸燕麦叶片Pn和Gs同步下降，Ci显著提高，说明Pn下降主要不是由Gs降低所致，而可能是由于非气孔因素阻碍了CO2的利用。类囊体垛叠程度降低(叶绿素a/b下降，表1)反映的叶绿体超微结构破坏也佐证了这一点。外源H2O2提高受旱裸燕麦叶片Pn、Gs和Ci说明H2O2主要通过保护叶绿体结构、增加Gs促进Pn的提高。水分利用效率(WUE)提高是植物耐旱性增强的重要途径。外源H2O2处理使干旱胁迫下裸燕麦叶片WUE显著提高，其原因可能包括两个方面：一方面外源H2O2提高了干旱胁迫下叶片的Pn，降低了Tr，叶片蒸腾量减少，从而提高了WUE；另一方面外源H2O2提高了干旱胁迫下可溶性糖和脯氨酸等渗透调节物质含量，增强了细胞保水能力，从而提高了叶片相对含水量，使WUE增大。综上所述，外源H2O2在维持干旱胁迫下裸燕麦叶片气孔开放、提高叶片碳同化能力及水分利用效率方面发挥着重要作用。然而，外源H2O2对干旱胁迫下植物光能吸收、传递、耗散和分配的影响机制尚需进一步探究。需要指出的是本研究是在营养不受限的条件下采用盆栽试验以PEG模拟的干旱胁迫下白燕7号这一裸燕麦单一品种对外源H2O2的生理响应特征，试验条件与大田实际的生产条件有较大差异。因此，还需进一步采用大田控水试验探讨外源H2O2对不同抗旱性裸燕麦品种生理响应的调控机理。