一株溶磷菌的分离鉴定及溶磷促生作用

薛应钰，叶 巍，杨 树，李 培，徐秉良

(甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

磷素是植物生长发育所必需的三大矿质营养元素之一，它对植物的生长发育和品质提高有重要意义[1]。然而，自然条件下土壤中90%以上的磷通常是以难溶的金属螯合物形式存在的无效磷，植物难以直接吸收利用[2]，施用磷肥(包括有机和化学磷肥)是土壤磷素的主要来源，但是，施入的磷肥当季利用率仅为5%～25%，大部分由于很快发生专性吸附和化学沉淀固定作用而形成Ca-P，Fe-P 和Al-P 等难溶性磷酸盐(无效态)积累在土壤中[3-4]，土壤有效磷的缺乏已成为限制植物生长的主要因素之一。因此，挖掘土壤潜在的磷库资源，寻求新的方法提高磷肥利用率迫在眉睫。研究表明，植物根际土壤中存在的大量溶磷微生物(Phosphate-soluble microorganisms，PSMs)可以将土壤中难溶性磷转化成植物能够吸收利用的可溶性磷，自Staltrom[5]发现土壤中存在溶磷微生物以来，至今已报道的溶磷微生物达36 个属，89个种[6]，且真菌的溶磷能力大于细菌，溶磷性能稳定[7]。溶磷微生物拥有溶解难溶磷的能力，被公认为安全、经济、高效的活化土壤难溶磷的生物措施，具有重大的开发应用价值。

土壤溶磷微生物种类繁多，生态环境、土壤类型、作物根际等条件下的差异均会导致溶磷微生物的分布不同[8]。易艳梅等[9]对不同生态环境土壤中溶磷微生物的研究发现，磷矿区溶磷微生物数量多、种类丰度高；盐渍土溶磷细菌的优势种群单一；重金属污染区最少，且以巨大芽孢杆菌为主。溶磷微生物在土壤中的数量、种类在不同的土壤类型中也有差异。各类土壤中溶磷微生物的数量分布呈现：黑钙土>黄棕壤>白土>红壤>砖红壤>瓦碱土[10]；黄伟等[11]发现，我国热带亚热带的黄棕壤和红壤中溶磷细菌种类繁多，东北黑钙土中溶磷细菌的数量很多，但丰度低，以芽孢杆菌(Bacillus)和假单胞菌(Pseudomonas)为主。种植不同植物的土壤中主要溶磷微生物的分布有差异。林启美等[12]通过对不同植物根际土壤溶磷菌的数量及种群结构的分析发现菜地土壤溶磷细菌的数量和种类最多，农田、菜地和草地的土壤以假单胞菌属为主，但农田土壤有一半是沙雷氏菌属(Serratia)，而菜地约有50%是欧文氏菌属(Erwinia)，草地土壤有大量的芽孢杆菌属和固氮菌属(Azotobacter)。林地土壤没有假单胞菌属、芽孢杆菌属和固氮菌属。不同植物根际溶磷微生物的分布也有所不同。小麦根际溶磷菌主要为假单胞菌属和埃希氏菌属(Escherichia)[13]，水稻根际主要为芽孢杆菌属和土壤单胞菌属(Agromonas)[14]，玉米根际溶磷微生物主要是欧文氏菌属[15]。而且，根际土壤中溶磷菌的丰富度比非根际土壤更加复杂[16]。

目前，绝大多数溶磷菌株是从作物根际土壤中获得，而有些溶磷菌是从特殊环境中分离，以期更好地利用此类菌株具有溶磷功能和兼具适应土著环境的特性[17]。Chatli 等[18]从低温沙漠地区分离了溶磷青霉菌株FC28、FC39，对磷酸三钙的溶解量分别为136.9 mg·L-1和103.3 mg·L-1；Bhattacharya 等[19]从蚯蚓粪便中分离到溶磷黑曲霉(Aspergillusniger)菌株V1，对磷矿粉最大溶解率为36%；Naveenkumar等[20]从槟榔壳废弃物中获得了构巢曲霉(Spergillusnidulans)菌株Strain-1，对磷酸三钙的溶解量为200 mg·L-1；Rinu 等[21]从海拔1 800～3 610 m 的喜马拉雅山脉土壤中分离到溶磷菌株ITCC2546、ITCC4210 和ARIFCC771，在盆栽实验中使玉米种子干重分别增加10.71%、33.33% 和21.43%；李海云等[22]从猪粪堆肥中筛选到溶磷产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)菌株PSM-1，对磷酸三钙的溶解量为138.36 mg·L-1。可见，在特定环境条件下溶磷菌具有其特有性和多样性。目前，针对民勤荒漠绿洲过渡带特殊的地理区域，关于溶磷菌筛选的研究报道较少。

因此，以生长在民勤荒漠绿洲过渡带植物白刺为研究物种，对其根际土壤中的根际溶磷菌进行分离和筛选，并对筛选获得的高效溶磷菌株进行 ITS 序列分析，确定其分类学地位，研究溶磷特性及促生作用，以期为植物根际促生菌的开发利用和土壤改良提供优良菌种资源。

1 材料与方法

1.1 土壤样品来源

采样点位于甘肃省民勤县薛百乡沙井子，地理位置E103°36′17.3″，N38°44′27.2″，海拔为1 378 m，属典型的温带大陆性极干旱荒漠气候区，是民勤绿洲向巴丹吉林沙漠过渡的地带。年平均降水量113.2 mm，年平均蒸发量2 604.3 mm，年平均气温7.6℃，土壤类型为棕漠土，储水能力弱，土壤有机质含量低，属白刺(N.tangutorum)集中分布地带。于2014年8月采用五点取样法采集白刺灌丛根际土样，采样时，选取采土点后铲去表层土后深挖20～30 cm，以保证样本中包含较多的根际微生物。将白刺根系上一些细根和黏附其上的土壤一起装入事先准备的无菌塑料袋，带回实验室，剔除石块、植物残根等杂物贮存于塑料袋内，置4℃冰箱中保存备用。

1.2培养基

1.2.1 溶磷培养基(NBRIP培养基) (NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)25 g，葡萄糖10.0 g，pH7.0～7.5，固体培养基加2%的琼脂粉，115℃ 30 min灭菌备用。

1.2.2 PDA培养基 马铃薯200 g,葡萄糖20.0 g,琼脂18.0 g,蒸馏水定容至1 000 mL。

1.3 方法

1.3.1 溶磷真菌的分离筛选 采用稀释分离法，称取10 g土样加到盛有90 mL无菌水的三角瓶中，加入玻璃珠，置于180 r·min-1的摇床上 28℃恒温振荡培养48 h，然后用10倍稀释法分别配制10-3、10-4、10-5的土壤悬液，取0.1 mL分别接种到NBRIP固体平板上涂布均匀，每个浓度涂布3个平板。倒置于培养箱中，28℃培养7 d，记录溶磷圈直径(D′)与菌落直径(D)。采用溶磷圈法(D′/D值)对溶磷菌的溶磷性能进行定性测试，筛选出D/d值最大的菌株，转接到PDA平板上进行纯化，将纯化后的菌株转接到PDA 斜面，4℃保藏。

1.3.2 溶磷特性研究

(1)固体培养条件下溶磷能力测定 将灭菌后的培养基在倒平板之前加入Triton X-100溶液，每100 mL培养基加入5 mL的1% Triton X-100，然后挑取菌株P-1407孢子分别接种于NBRIP平板培养基上，置于28℃光照培养，每隔1d观察菌落周围有无透明圈，测量记录溶磷圈直径(D′)与菌落直径(D)，共测量10 d，并计算D′/D值。

(2)液体培养条件下溶磷能力测定 采用磷钼蓝分光光度法[23]，略作修改。制取菌株P-1407孢子悬浮液(108cfu·mL-1)，取1 mL菌液接种于盛有100 mL NBRIP液体培养基的三角瓶中，设不接菌为对照，每个处理重复3次，置于28℃，150 r·min-1摇床培养10 d，分别培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d后过滤取上清液，将菌液6 000 r·min-1离心30 min，吸取上清液1 mL，加入准备好的试管中，另准备一支试管加入1 mL蒸馏水做对照，再向试管中加入2 mL水，2 mL反应终止液，摇匀后37℃水浴加热10 min，利用UV3010紫外可见分光光度计在415 nm处通过比色法测定吸光光度值(OD)并记录数据，每个处理隔5 s测量1次，共测3次，取平均值；ΔOD415=样品ΔOD415-对照ΔOD415，根据标准曲线方程计算出菌液中可溶性磷的含量；同时用pHS-29A 型酸度计直接测定培养液的pH值并记录数据。

1.3.3 有机酸种类及含量的测定 采用乔志伟[24]和乔欢[25]等的方法。取1.3.2中(2)的培养液1 mL，在4℃，12 000 r·min-1、离心10 min，取上清液过滤，采用Agilent1200 液相色谱仪进行HPLC分析，确定有机酸的种类和浓度。

有机酸色谱条件为：色谱柱反相C18柱；流动相—甲醇和1 mmol·L-1KH2PO4(V/V)3∶97；流速0.8 mL·min-1；测定波长：203 nm；进样量20 μL；柱温25℃；出峰顺序依次为草酸、甲酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸。

葡萄糖酸色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAX SB-Phenyl，4.6 mm×250 mm，5μm；流动相：A：0.1% H3PO4，B：CH3CN；流速：1 mL·min-1；梯度：0～4 min；B 相：40%；5～7 min；B：90%；测定波长：203 nm；进样体积：2 μL；柱温25℃。

1.3.4 盐碱度对溶磷真菌解磷能力的影响 将菌株P-1407在PDA液体培养基中振荡培养3 d后，取1 mL分别接种至0%、2%、4%、6%、8%、10% NaCl和pH值为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的NBRIP液体培养基中，30℃、160 r·min-1振荡培养7 d，采用钼锑抗比色法测定各处理的可溶性磷含量。

1.3.5 溶磷菌株的鉴定

(1)形态学鉴定 将保存的高效溶磷菌株转接到PDA平板上，28℃培养7 d，对菌落生长速率、正反面颜色、气味等培养性状以及无性型的产孢结构、分生方式、孢子形态、颜色、大小、瓶梗形态、数目和着生方式等显微形态进行观察并记录，进行初步鉴定。

(2)rDNA-ITS序列分析 将高效溶磷菌株取其孢子转接于PDA液体培养基中，振荡培养48 h，过滤，干燥，研磨，并用螯合树脂法提取DNA。利用真菌通用引物ITS1、ITS4对提取的DNA进行PCR扩增。PCR反应体系为10×PCR buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，Taq酶0.5 μL，10 mmol·L-1ITSl/ITS4 1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 36.5 μL。反应程序为94℃变性3 min，94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后，72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物经1%琼脂糖进行电泳检测，纯化后送上海生物工程有限公司进行序列测定。将获得的DNA序列，输入GenBank，与数据库中的所有序列进行Blast比对，选取同源性95%以上的菌株序列，并利用MEGA5.0构建系统发育树。

1.3.6 菌株P-1407对番茄促生作用 (1)菌株P-1407发酵液的制备 将预先分离纯化得到的菌株P-1407接种于PDA培养基，置于28℃培养箱中，28℃光暗交替(12 h/12 h)培养5 d后，加入5 mL无菌水和1滴Tween-80配制分生孢子悬浮液，利用血球计数板计数其浓度，无菌水稀释，最终使其浓度为1×107cfu·mL-1，取1 mL悬浮液于50 mL NBRIP液体培养基，置于150 r·min-1的摇床25℃振荡培养7 d，然后通过双层滤膜过滤，将得到的滤液分别用无菌水稀释为50、100倍和200倍液。以NBRIP液体培养基加入1 mL无菌水和1滴Tween-80为对照，处理和对照均为3个重复。

(2)菌株P-1407对番茄种子的影响 将供试的番茄种子经5%NaClO溶液进行消毒处理5 min，消毒后将其通过无菌水充分冲洗5次，然后将其置于直径为9 cm的培养皿内进行种子处理。处理的过程中培养皿中含有一层纱布和两层滤纸进行保湿处理，各处理和对照均为100粒种子，重复6次。然后将配制好的不同浓度P-1407发酵液分别加15 mL于每个处理中，对照加入等量的NBRIP滤液，于温度为25℃和光照为16 h/8 h的培养箱中进行培养。处理后待种子的胚根长度超过种子长度一半时开始统计种子的发芽率、发芽指数和活力指数[26]。

发芽率(%)=(发芽种子总数/供试种子总数)×100

发芽指数=∑Gt/Dt

式中，Gt为t时间内的发芽数，Dt为相应的发芽天数。

活力指数=发芽指数×单株平均干重

(3)温室试验 将经过5%NaClO消毒(5 min)处理的番茄种子，经无菌水充分冲洗后种植于装入灭菌土壤的塑料钵中(100粒·钵-1)。种植后待幼苗生长到两叶一心期时，分别将配制的发酵液(20 mL) 浇灌于植株根系周围的土壤中，以浇灌等量的NBRIP滤液为对照。试验在温度为25℃，光照为16 h/8 h的温室中进行，且各处理和对照均重复6次。处理后第30天，从每个处理和对照中分别随机抽取60株幼苗，测定番茄幼苗形态指标、叶绿素和丙二醛含量。根长和株高采用刻度尺进行测量，整株鲜重采用电子天平称量。同时将新鲜的植株通过干燥箱进行杀青处理，处理温度为105℃，时间为30 min，然后调节温度为80℃烘干，并称量干重[27]。番茄幼苗叶绿素含量测定采用分光光度法[28]，丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[29]。

2 结果与分析

2.1 溶磷菌株的分离

从民勤荒漠绿洲过渡带白刺根际土壤样品中筛选到具有溶磷效果的真菌13株。在NBRIP固体平板上培养7 d，菌株P-1407溶磷圈直径(D′)最大，达5.25 cm，菌落直径(D)为2.14 cm，溶磷菌圈直径与菌落直径之比(D′/D)最大为2.45，其余12个菌株的D′/D值均小于2(表1)。因此，选取菌株P-1407进一步进行分子鉴定以及溶磷特性研究。

由表2可以看出，菌株P-1407在NBRIP固体平板上培养了10 d，可以形成肉眼可见的透明溶磷圈，而且其溶磷圈直径(D′)和菌落直径(D)均随着培养时间而不断增大，菌落直径由第1天的0.73 cm增大到第10天的2.61 cm，溶磷圈直径由第1天的0.75 cn增大到第10天的5.79 cm。但是通过计算D′/D值发现，培养7 d的D′/D值最大，为2.52，表明该菌株在溶磷固体培养基上生长良好，其溶磷能力较好。

表1 13株真菌在固体培养条件下溶磷能力测定结果

注：同一列不同字母表示在0.05水平差异显著。下同。

Note: The different letters in the same row indicate significant difference atP<0.05 level. The same below．

表2 菌株P-1407在固体培养条件下溶磷能力

2.2 菌株P-1407溶磷能力的测定

液体培养条件下溶磷能力试验结果表明(图1)，菌株P-1407在NBRIP液体培养基中的溶磷能力随振荡培养时间而变化，在一定时间范围内达到最高值后，可溶性磷含量开始下降，也就是说随着培养时间的延长，菌株P-1407发酵液中的可溶性磷含量逐渐增多，最初1～2 d内，发酵液中可溶性磷含量增加较慢，在2～6 d增加较快，在7 d时达到最大值557 μg·mL-1。此后发酵液可溶性磷含量略有降低，液溶磷量基本稳定，而对照组中由于没有接种解磷菌株，其发酵液里的可溶性磷含量很低，而且基本一直维持在最初的低水平。

图1 菌株P-1407在液体培养条件下溶磷效果 和发酵液pH值变化Fig.1 Variation of phosphate solubilization capacity and pH value of P-1407 in liquid medium

2.3 不同培养时间下发酵液的pH值变化

由图1可以看出，NBRIP液体培养基接种菌株P-1407后，发酵液的pH值随着培养时间的延长而不断变化，总体呈现出一个先降低，然后基本稳定的趋势，在最初的7 d有明显的下降趋势，在第7天时pH值降到最低为3.7，但到第8天后pH值略有回升并稳定在4.5左右。与未接种培养液(pH=7)相比，整个培养周期内接种菌株发酵液的pH值都有下降趋势。

综合2.2和2.3，发现在整个培养周期内，发酵液液pH值与溶磷菌株P-1407溶磷量呈线性负相关，其线性方程为y=-203.14x+1037.6，R2=0.910,达极显著负相关(P<0.01)。随着溶磷量的增大，pH 值呈明显下降趋势，后期虽然变化幅度不大，但仍保持在较低水平，表明菌株P-1407在培养过程中会分泌弱酸性物质。

2.4 菌株P-1407 分泌有机酸种类及含量

高效液相色谱分析结果表明，菌株P-1407在溶磷过程中主要分泌3种有机酸，即葡萄糖酸、草酸和甲酸，其总量为8.4 g·L-1。其中葡萄糖酸含量最高，为5.7 g·L-1，占所产有机酸总量的67.85%；其次是草酸为2.3 g·L-1，占27.38%，甲酸含量最少，仅为0.4 g·L-1(表3)。

2.5 NaCl浓度对溶磷真菌解磷能力的影响

将菌株P-1407接种到含有不同浓度NaCl的NBRIP液体培养基培养7 d，结果表明，NaCl 浓度对菌株P-1407的溶磷能力有一定的影响。菌株P-1407在含有NaCl的发酵液中可溶性磷含量与对照(540.32 μg·mL-1)相比均有不同程度的下降，而且随着NaCl 浓度的升高，菌株P-1407的溶磷能力不断下降， NaCl 浓度为0～6%范围内，发酵液中的可溶性磷含量减少幅度较小，NaCl 浓度为6%时，可溶性磷含量仍保持在对照的80%左右，达468.29 μg·mL-1，而且与对照相比差异不显著，但是当NaCl 浓度高于6%时，发酵液中可溶性磷含量迅速下降，NaCl 浓度为10%时，发酵液中可溶性磷含量仅为305.33 μg·mL-1，仍达对照的56.51%，说明低浓度的盐溶液对菌株P-1407的解磷能力影响较小。

表3 菌株P-1407分泌有机酸的种类和含量

菌株P-1407在含有不同浓度NaCl液体培养基培养7 d，发酵液的pH值与对照相比均有所升高，而且随着NaCl浓度的增大，pH值升高幅度也增大，即随着NaCl 浓度的升高，发酵液的pH值逐渐升高，当NaCl浓度为2%时，发酵液pH值为4.02,当NaCl浓度升至10%时，发酵液pH值为4.97,表明高浓度NaCl抑制菌株P-1407产酸，溶磷能力降低。

2.6 碱性条件对溶磷真菌解磷能力的影响

由图3可以看出，碱性条件下，随着培养基pH值的升高，菌株P-1407的溶磷能力逐渐降低，pH值为7.5、8和8.5时，发酵液中的可溶性磷含量分别为489.27、469.02 μg·mL-1和433.19 μg·mL-1，但是与对照(pH=7)之间无显著差异；当培养基pH值为9时，培养基中可溶性磷含量急剧下降，仅为151.71 μg·mL-1，显著低于对照。

图2 NaCl 浓度对菌株 P-1407溶磷能力和 发酵液pH值的影响Fig.2 Effects of different NaCl concentration on phosphate solubilization capacity and pH value of P-1407

图3 培养基pH值对菌株 P-1407溶磷能力和 发酵液pH值的影响Fig.3 Effects of different pH value on phosphate solubilization capacity and pH value of P-1407

发酵液的pH值随着培养基pH值的升高而升高，培养基pH值为7.5、8和8.5时，发酵液pH值分别为4.32、4.43和4.85，与对照(pH=7)相比差异不显著，而且增幅较小，分别为0.61、0.72和1.14，但是，当培养基pH值为9时，发酵液pH值急剧升高，达5.98，增幅为2.27，显著高于对照。

2.7 溶磷菌株P-1407的鉴定

2.7.1 培养性状和形态特征 在PDA培养基上菌丝生长迅速，28℃培养，初期产生白色菌丝，无色素，后期分生孢子结构大量产生，呈灰绿色至暗绿色，无渗出液。7 d直径为2.0～3.0 cm，正面灰绿色，背面灰黄色。分生孢子梗有隔膜，呈扫帚状，在顶囊上生出2层小梗，下面一层为梗基，每个梗基上再着生几个小梗，从每个小梗的顶端相继生出一串分生孢子，分生孢子灰绿色，圆形或椭圆形，直径3.0～5.6 μm。初步确定为青霉属一种(Penicilliumsp)。

2.7.2 分子鉴定 以溶磷真菌P-1407的DNA作为模板，利用通用引物ITS1和ITS4，进行PCR扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，在500～700 bp之间得到一条明亮的条带，且没有其他非特异性条带(图1)。切胶回收目的片段并进行ITS序列测定，得到长度为567bp的序列。通过Blast将该序列与GenBank数据库中序列进行同源性比对，结果表明，解磷菌株P-1407与草酸青霉(Penicilliumoxalicum)的同源性为99%，其同源性系统进化树如图5。综合形态特征和ITS基因序列同源性分析，将菌株P-1407鉴定为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)。

注：A 菌落正面；B 菌落背面；C 分生孢子梗(40×)；D 分生孢子(40×)。 Notes：A：The front of colony；B：The back of colony；C：Conidiophore(40×)；D：Conidium(40×).图4 溶磷菌株P-1407培养性状和显微形态特征Fig.4 The cultural characteristics and micromorphological characters of phosphate-solubilizing strain P-1407

2.8 溶磷菌株P-1407对番茄促生作用

2.8.1 菌株P-1407发酵液对番茄种子的影响 菌株P-1407发酵液对番茄种子活性有显著的影响，不同浓度的发酵液处理番茄种子以后，其发芽率、发芽指数和活力指数均显著提高，尤其是100×发酵液处理后，番茄种子的发芽率、发芽指数和活力指数均最高，分别为96.54%、14.56和9.78，分别较对照提高了2.53%、49.33%和105.89%(表4)。

2.8.2 菌株P-1407发酵液对番茄幼苗生长的影响 由表5可以看出，菌株P-1407发酵液对番茄幼苗有明显的促生作用，且与对照相比不同稀释倍数发酵液对幼苗生长的影响存在显著的差异，不同浓度的发酵液处理幼苗后，幼苗的株高、根长、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重显著高于对照，其中100×稀释液处理后效果最好，幼苗的株高、根长、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重和地下部干重分别为20.3 cm、18.3 cm、1.61 g、0.184 g、1.11 g和0.112 g，分别增加了109.27%、78.41%、82.95%、121.69%、94.74%和64.71%，显著高于对照。

注：M: DNA marker DL2000; 1～3: PCR 产物。 Notes: M: DNA marker DL2000; 1～3: PCR amplification product.图5 溶磷菌株P-1407的 PCR 扩增产物电泳图Fig.5 PCR amplification product electrophoretograms of phosphate-solubilizing strain P-1407

2.8.3 菌株P-1407发酵液对番茄幼苗叶绿素和丙二醛含量的影响 由图7可以看出，不同浓度的菌株P-1407发酵液对番茄叶片中的叶绿素含量影响较大， 各个浓度梯度相较对照的叶绿素含量均有较大提高， 其中100×处理后的叶片叶绿素含量最高，达 3.22 mg·g-1， 显著高于对照(2.45 mg·g-1)，提高了31.4%。

图6 基于18S rDNA ITS 序列的溶磷菌株P-1407系统发育树Fig.6 The phylogenetic tree of efficient phosphate-solubilizing strain P-1407 based on 18S rDNA ITS sequences

浓度Concentration发芽率/%Germination rate提高率/%Increasing rate发芽指数Germination index提高率/%Increasing rate活力指数Vigor index提高率/%Increasing rate200×93.33±2.31b2.0210.38±0.98c6.465.38±0.92c13.26100×96.54±2.69a5.5314.56±0.57a49.339.78±1.03a105.8950×94.04±2.47b2.8012.32±0.98b26.366.95±0.63b46.32原液Stock solution93.58±1.87b2.3011.59±0.49bc18.876.07±0.94bc27.79对照Control91.48±1.05c09.75±0.81d04.75±0.59c0

表5 菌株P-1407发酵液对番茄幼苗生长的影响

菌株P-1407发酵液处理， 对番茄叶片丙二醛含量有较明显的影响，不同浓度发酵液处理后，番茄叶片的丙二醛含量均出现不同程度的减少，其中100×处理后叶片中丙二醛含量最低，为1.85 mmol·g-1，与对照(2.84 mmol·g-1)差异显著(图8)。

3 讨论与结论

土壤中的微生物是土壤肥力的核心，数量巨大，种类繁多，而且部分种类对土壤氮、磷和钾等养分的转化和供给起到非常重要的作用[30]。土壤中的溶磷微生物主要有细菌、真菌和放线菌，与细菌相比，真菌的溶磷能力强而且稳定，因此，挖掘可利用的溶磷真菌资源受到人们的高度重视。目前已报道的溶磷真菌主要有青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、镰刀菌(Fusarium)、小丝核菌(Sclerotium)等[31]，其中以曲霉和青霉的研究居多，尤其青霉达26 种之多[17]。本研究从甘肃民勤荒漠绿洲过渡带白刺根际土壤中分离到一株溶磷菌株P-1407，结合形态学特征和分子生物学特性鉴定为草酸青霉。

图7 菌株P-1407发酵液对番茄叶片叶绿素 含量的影响Fig.7 Effect of strain P-1407 on chlorophyll content of tomato plant

图8 菌株P-1407发酵液对番茄叶片丙二醛 含量的影响Fig.8 Effect of strain P-1407 on malodialdehyde content of tomato plant

溶磷圈法和液体培养是判定菌株是否具有溶磷能力以及解磷能力大小常用的方法。多数的研究表明，同一菌株而言，D/d值大小与菌株在液体振荡培养条件下的溶磷量没有必然的相关性，溶磷圈法只能对菌株有无溶磷能力作定性判断，而液体培养法测出的菌株溶磷能力，理论上更为合理和科学[32]。本试验采用溶磷圈法和液体培养对P-1407不同培养时间的溶磷效果进行研究，发现不同培养时间的D/d值大小与液体培养发酵液中可溶性磷含量的变化趋势一致，说明对于P-1407菌株来说，通过测定其D/d值可以直观反映出其溶磷能力的强弱。

菌株的溶磷能力与菌株种类、土壤环境、植物种类和根系分泌物不同有关[33]，因此，不同植物或同一植物根际溶磷菌的溶磷能力差异较大。范丙全等[34]筛选得到2株具有溶磷作用的草酸青霉菌P8和Pn1对磷酸钙的溶解能力分别为 194.2 μg·mL-1和 136.4 μg·mL-1；王莉晶[35]测定的草酸青霉C2'菌株对于磷酸钙的溶解量为557.68 μg·mL-1，史发超[1]测定的斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)P83菌株对磷酸钙的溶解能力达956 μg·mL-1。本试验分离的草酸青霉P-1407菌株对磷酸钙的最高溶磷量达541.32 μg·mL-1，虽然溶磷能力低于P83菌株，但显著优于P8和Pn1菌株，也优于Chatli等[18]从低温沙漠地区分离的溶磷青霉菌株FC28(136.9 mg·L-1)、FC39(103.3 mg·L-1)，与C2'菌株解磷能力相当，说明其具有良好的溶磷能力。

溶磷微生物培养液溶磷量与培养液pH值的变化关系比较复杂，有研究表明溶磷能力与溶液pH 值及可滴定酸含量相关[36-37]，但也有些结果证明两者间不存在显著相关性[38-39]。本研究显示，草酸青霉P-1407菌株在培养时间内，其溶磷能力与发酵液pH值呈显著负相关，当培养7d的溶磷量达最大值，此时其pH值最低，这说明溶磷真菌能够分泌可滴定酸来溶解难溶磷源。多种研究表明，溶磷菌的溶磷机理具有多样性[34]。一般认为，溶磷真菌在生长过程中分泌低分子量有机酸类物质是其溶磷的主要机理之一[40]。目前，溶磷菌产生的有机酸主要有葡萄糖酸、草酸、乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、富马酸、丙二酸和琥珀酸等[41-42]，这些有机酸通常一方面能够降低培养液pH值，另一方面可与Fe3+、Ca2+和Al3+等金属离子螯合，从而使不溶性磷或难溶磷转化为有效磷[43-44]。而且，不同溶磷菌所分泌的有机酸数量和种类差异很大。乔欢[25]等研究得出嗜松青霉(P.pinophilum)分泌的葡萄糖酸和草酸在对磷酸钙和磷酸铝的溶解发挥了较大的作用。Cunnin-gham[45]认为，拜莱青霉(P.bilaii)产生的草酸和柠檬酸是溶解磷酸钙的主要机制。本研究使用液相色谱分析表明，草酸青霉P-1407J菌株可以分泌3种有机酸，其中葡萄糖酸含量最高，其次为草酸，说明该菌株对磷酸钙溶解过程中，葡萄糖酸及草酸发挥了重要作用。与王莉晶等[20]报道的P.oxalicum在代谢过程中产生苹果酸和酒石酸结果不一致，这可能是由于溶磷菌株的筛选地不同，其地理环境的差异所造成的。

另外，在自然条件恶劣的环境中，传统物理化学技术难以发挥作用的情况下，溶磷微生物在改良土壤和推进植被群落结构演替中可发挥独特的作用[46]。溶磷真菌不但能够改良盐碱土壤的磷素营养供应，还可以降低盐碱土的pH值，对盐碱土壤的改良具有重要的作用。本试验分离得到的草酸青霉P-1407菌株在NaCl浓度小于6%、pH<8.5时其溶磷能力所受影响不大，这对寻找发现可在盐碱土壤中有效定殖的菌株，改善磷循环有实际的意义。以后应该通过培养和非培养相结合的方法来关注长期定位实验解磷菌的定殖效果以及与土壤土著微生物群落的相互作用。