木霉耐盐突变菌株的紫外诱变选育

张树武，徐秉良，刘 佳，石成才

(甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

土壤盐渍化已成为一个世界性问题，可造成作物严重减产，每年由于其造成的经济损失达10亿美元[1-3]。据报道，目前地球上已有超过6%的耕地严重受到盐胁迫的影响，且在干旱和半干旱地区较为严重[4]。同时，已有研究表明盐胁迫能够引起或造成植物形态特征、生理和代谢反应发生变化，以及改变植物渗透压和活性氧反应等过程，进而导致植物体内过氧化脂质和抗氧化物质失活[5]。因此，急需开发有效技术来减轻和降低盐胁迫对植物生长和发育带来的负面影响。Phang等[6]研究表明，传统育种和转基因技术曾被广泛用于耐盐性植物品种的选育，但是传统育种存在周期长和效率低，转基因技术存在高成本等问题[7-8]。同时，目前已有许多学者尝试利用外源化合物减轻非生物胁迫对植物生长造成的负面影响，如已证明壳聚糖[1]、一氧化氮、硝酸钙[9]及茉莉酸[10]等能够显著改善和提高小麦耐盐水平，但对于其机理目前尚未明确。同时，随着近年来在该方面研究的不断深入，有关利用植物根际促生细菌和真菌诱导植物抗非生物胁迫方面已有相关的报道，如菌根真菌、根瘤菌、植物根际促生菌和内生真菌等能够改善植物生长[11]，但有关高效耐盐微生物突变菌株紫外诱变选育方面的研究和报道较少。

木霉菌(Trichodermaspp.)作为土壤中存在的一类真菌，广泛用于不同种类植物病害的生物防治[12-13]。此外，Mastouri等[14]研究表明在生物和非生物胁迫下，哈茨木霉T22(T.harzianum)菌株能够提高番茄种子的萌发率，减轻幼苗的氧化损伤，但是随着盐浓度的升高，哈茨木霉T22菌株活性显著降低，并且由于外界环境的影响其耐盐性效果不稳定。因此，如何提高木霉菌的耐盐性已是目前急需解决的一个问题。

因此，本试验通过利用NaCl溶液模拟盐协迫逆境条件，并利用紫外诱变提高和改良深绿木霉(Trichodermaatroviride)T-YM菌株耐盐性，旨在探明紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株生长和耐盐性的影响，将为进一步提高其耐盐性奠定理论基础，同时对于进一步改良和扩大木霉菌的应用范围具有重要的实践意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 深绿木霉T-YM菌株分离于甘肃民勤县玉米根际盐碱土壤，并保存于甘肃农业大学植物病理学实验室。

1.1.2 供试化学试剂 NaCl分析纯AR，无色晶体，由国药集团化学试剂有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 分生孢子悬浮液制备 将预先分离筛选并保存的深绿木霉T-YM菌株转接于PDA培养基，置于25℃恒温培养箱中培养备用。培养6 d后，待其产生大量分生孢子后，向培养基表面加入5 mL无菌水和1滴吐温-80，洗脱菌落表面分生孢子并将其收集于盛有玻璃珠的120 mL三角瓶中，置于温度为25℃和转速为200 rpm·min-1恒温摇床振荡30 min，使其分生孢子分散均匀，即为分生孢子悬浮液，并经血球计数板计数，使其孢子浓度为1×106CFU·mL-1，备用。

1.2.2 深绿木霉T-YM菌株紫外诱变处理 诱变处理前30 min打开紫外灯(10 W)使其功率稳定。将配制好的深绿木霉T-YM菌株分生孢子悬浮液(1×106CFU·mL-1)加入经灭菌处理的1.5 mL离心管中，每管加入1 mL孢子悬浮液。然后，置于紫外灯(10 W) 10 cm处分别处理0.5、1、3、5 min和7 min。试验以等量未经诱变的原始菌株分生孢子悬浮液作为对照，每个处理和对照均重复6次。

1.2.3 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌落生长和产孢量的影响 采用单孢分离法，对经紫外诱变处理的深绿木霉T-YM和原始菌株分生孢子悬浮液进行单孢分离，然后将分离的单个孢子接种于PDA平板表面，并置于温度为25℃，光照为16 h的恒温培养箱中培养，每个处理和对照均重复6次。培养3 d后，将经不同时间紫外诱变处理后生长较好的突变菌株，利用打孔器(Ф=5 mm)在其菌落边缘打取菌饼，并转接于新的PDA培养基，置于温度为25℃和光照为16 h的培养箱培养2 d后，采用“十字交叉法”测量菌落直径，每隔1 d测定和观察1次，并于接种培养7 d时测定其产孢量。试验以接种原始菌株作为对照，每个处理和对照均重复6次。

1.2.4 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌丝生长的影响 配制相同浓度的原始和诱变后经单孢分离且生长较好的突变菌株分生孢子悬浮液(1×106CFU·mL-1)，并吸取1 mL孢子悬浮液接种于60 mL PDB液体培养基中，置于温度为25℃，转速为180 rpm·min-1的恒温摇床振荡培养5 d，并经无菌滤纸过滤后收集菌丝。然后，经60℃恒温烘干，计算其菌丝干重。以接种等量原始菌株孢子悬浮液作为对照，试验每个处理和对照均重复6次。

1.2.5 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株耐盐性的影响 待PDA培养基(每三角瓶120 mL)冷却到50℃～60℃时，分别加入NaCl晶体，并使NaCl溶液浓度分别为0、10、20、30、40 mg·mL-1和50 mg·mL-1。充分摇匀后，均匀倒入6个培养皿中制成平板。然后，将获得的突变菌株经单孢分离并纯化培养5 d的菌落经灭菌的打孔器(Ф=5 mm)制取菌饼接种于含有不同浓度NaCl溶液的PDA平板中央。将各处理和对照均置于25℃和16 h光照条件的恒温培养箱内培养，试验以原始菌株作为对照，每个处理和对照均重复6次。培养2 d后，采用“十字交叉法”测量菌落直径，每隔1 d测定1次，并于培养第7天测量其产孢量。

待PDB培养基(每三角瓶60 mL)冷却到50℃～60℃左右时，分别加入NaCl晶体，并使NaCl溶液浓度分别为0、10、20、30、40 mg·mL-1和50 mg·mL-1。配制相同浓度的原始和诱变后经单孢分离并纯化的突变菌株分生孢子悬浮液(1×106CFU·mL-1)，并吸取1 mL孢子悬浮液接种于60 mL PDB液体培养基中，置于温度为25℃，转速为180 rpm·min-1的恒温摇床振荡培养5 d，并经无菌滤纸过滤后收集菌丝。然后，经60℃恒温烘干称重，计算菌丝干重。试验以接种等量原始菌株孢子悬浮液作为对照，试验每个处理和对照均重复6次。

1.2.6 耐盐性突变菌株复筛及其耐盐遗传稳定性测定 将经紫外诱变获得的耐盐性较强的深绿木霉T-YM正突变菌株(诱变时间为0.5 min和NaCl浓度为10 mg·mL-1) 参考1.2.5方法接种于培养基进行传代培养，并以传代培养后突变菌株的菌落直径、产孢量和菌丝干重作为测定指标评价其耐盐遗传稳定性。试验每个处理和对照均重复6次。突变菌株传代培养菌落直径测定时间以接种培养4 d为1代，共传代培养10次；产孢量测定时间以培养7 d为1代，共传代培养10次；菌丝干重测定时间以培养5 d为1代，共传代培养10次。

1.3 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 16.0软件分别进行数据处理、图表绘制和方差分析。采用单因素方差分析和Duncan氏新复极差法统计各处理平均数的差异和进行差异显著性检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌落生长的影响

表1表明，紫外诱变处理获得的深绿木霉T-YM突变菌株在活化培养第1天和第2天时，在不同诱变时间下其生长存在明显的差异。与野生型菌株相比，突变菌株在培养第1天和第2天时，当诱变时间为3 min时能够显著提高突变菌株的菌落生长速度，其生长速率与对照相比分别提高了22.45%和12.92%，但当紫外诱变时间为7 min时，突变菌株菌落生长速度与对照相比显著降低，其生长速率在诱变处理后培养第1天和第2天时分别降低30.61%和6.96%。然而，诱变处理培养后第3天，不同诱变时间下所获得的突变菌株生长速率与对照相比均无显著差异。

2.2 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株产孢量和菌丝生长量的影响

表2表明，与野生型菌株相比，当紫外诱变时间为0.5～5.0 min时，其对深绿木霉T-YM突变菌株产孢量和菌丝生长量均具有显著促进作用，但当诱变时间为7.0 min时，突变菌株产孢量降低，但与野生型菌株相比差异不显著。液体培养5 d，当紫外诱变时间为0.5 min和5 min时，能够显著增加深绿木霉T-YM突变菌株菌丝干重，且与对照相比，其菌丝干重分别增加42.22%和46.67%；液体培养7 d，当紫外诱变时间为3 min时，突变菌株产孢量增加最为显著，其产孢量与对照相比增加 28.82%。

表1 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌落生长的影响

注：表中数据均为6个重复的平均值。数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著，下同。

Note: The data in the
Table are means of six replicates. Different letters in the same column mean significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test, respectively. The same below.

2.3 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株生长速率的影响

表3表明，不同浓度NaCl溶液胁迫下，不同紫外诱变时间对深绿木霉T-YM突变菌株菌落生长均具有明显的影响。培养4 d时，不同诱变时间处理的菌落生长速度随着NaCl溶液浓度增加，整体呈降低趋势，但与对照(野生型菌株)相比，在不同浓度NaCl溶液(10～50 mg·mL-1)胁迫下，紫外诱变处理的菌落直径基本高于野生型菌株。当NaCl溶液浓度为0～10 mg·mL-1时，突变菌株生长速率与野生型菌株无显著差异，但当NaCl溶液浓度为20～50 mg·mL-1时，突变菌株生长速率均显著高于野生型菌株，且在诱变处理3 min时，其生长速率显著高于其它诱变时间获得的突变菌株。

表2 紫外诱变对深绿木霉T-YM菌丝干重 和产孢量的影响

注：表中数据均分别为处理后第5天和第7天时菌丝生长量和产孢量的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates for the dry weight of mycelia and quantity of spore production at 5 and 7 days after treatment, respectively.

2.4 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株产孢量的影响

表4表明，与野生型菌株相比，NaCl溶液胁迫下，不同紫外诱变时间对深绿木霉T-YM突变菌株的产孢量具有一定程度的影响，而且NaCl溶液浓度对诱变和野生型菌株的产孢量具有较明显的影响。当NaCl溶液浓度为10～50 mg·mL-1时，其产孢量随着NaCl溶液浓度增加显著降低。当诱变时间为0.5～5.0 min时，10 mg·mL-1NaCl处理的产孢量显著高于野生型菌株，但当诱变时间为7.0 min时，其产孢量显著低于野生型菌株。当NaCl浓度增加至20 mg·mL-1以上时，原始菌株和突变菌株产孢量均急骤下降。

表3 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌落生长的影响

注：表中数据均为接菌第4天后6个重复的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates at 4 days after inoculation.

表4 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株产孢量的影响/(106 CFU·mL-1)

注：表中数据均为接菌第7天后6个重复的平均值。

Note: The data in the
Table are means of six replicates at 7 days after inoculation.

2.5 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株菌丝干重的影响

表5表明，与野生型菌株相比，10 mg·mL-1NaCl溶液胁迫下，培养后不同诱变时间获得的突变菌株菌丝干重整体高于野生型菌株，尤其诱变时间为3 min时增加最为显著。随着NaCl溶液浓度增加，突变菌株和野生型菌株菌丝干重呈降低趋势。

2.6 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株耐盐遗传稳定性的影响

表6为10 mg·mL-1NaCl胁迫下，紫外诱变0.5 min获得的突变菌株经传代接种培养后的菌落生长状况。NaCl胁迫下突变菌株传代接种培养4 d后，不同代培养菌株间菌落直径无显著差异；培养5 d后，不同代培养菌株间菌丝干重无显著差异；培养7 d后，不同代培养菌株间产孢量无显著差异。

表5 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM菌株菌丝干重的影响/g

注：表中数据均为接菌第5天后6个重复平均值。

Note: The data in the Table are means of six replicates at 5 days after inoculation.

表6 NaCl胁迫下紫外诱变对深绿木霉T-YM 菌株耐盐遗传稳定性的影响

注：表中菌落直径、产孢量和菌丝干重数据均为接菌第4天、第7天和第5天后6个重复的平均值。

Note: The data of colony diameter, quantities of spores production, and dry weight of mycelia in the
Table are means of six replicates at 4 days, 7 days, and 5 days after inoculation, respectively.

3 结论与讨论

前期研究表明，高浓度盐胁迫对木霉菌生长速率、菌丝生长量和产孢量具有一定程度的抑制作用[15-16]，因而，为了获得具有更强耐盐性的木霉突变菌株，寻求改良和提高木霉菌耐盐性的技术和手段已成为目前研究的一种新趋势。据报道，改良微生物菌株的手段和方法主要有诱变、遗传改良和原生质体融合等技术[17-19]，其中诱变技术是目前应用较为广泛的一种技术，已被应用于多功能木霉菌突变菌株的研究[20]。在现有的诱变技术中，紫外诱变作为简便、实用和诱变效果明显的物理诱变因子，已被广泛应用于菌种改良[21]。本试验以盐碱土分离获得的1株深绿木霉T-YM菌株为原始菌株进行紫外诱变处理，结果表明当诱变时间为3 min时能够显著提高深绿木霉T-YM菌株的生长速率和产孢量，当诱变时间为5 min能够显著提高菌丝生长量。薛应钰等[22]研究表明在紫外照射强度20 W，照射时间40 min和照射距离30 cm时获得的诱变菌株生长速率和产孢量显著高于野生型菌株，其研究结果与本试验基本一致，但是其诱变条件与本试验存在差异，其原因可能由于不同微生物对紫外光的敏感性有所差异，进而导致其最佳的诱变条件不一致。

另外，在NaCl溶液模拟盐胁迫条件下，当诱变时间为0.5～5 min时，与对照相比诱变菌落直径、产孢量和菌丝干重整体高于野生型菌株，且当诱变处理时间为3 min时，诱变菌株的生长速率和产孢量显著提高，即显著提高其耐盐性。Mohamed等[23]研究发现，通过利用-辐射诱导获得2株具有稳定耐盐性的哈茨木霉突变体Th50M6和Th50M11，且在盐胁迫下突变菌株生长速率和产孢量，以及其对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)生物防治效果显著高于野生菌株。同时，2个耐盐性菌株在盐浓度为0～69 mM的培养基上其菌丝能够正常生长和产孢。另外，已有相关的研究报道了利用紫外诱变提高木霉菌的解磷能力和抗药性。薛应钰等[22]通过紫外诱变获得一株具备高效解磷能力的木霉突变株T2-8，其解磷能力显著高于野生型菌株。尹婷等[24]通过紫外光照射获得了4株对速克灵抗药性较强的深绿木霉菌株，但是有关利用紫外诱变提高木霉菌耐盐性方面尚未报道，在今后还有待进一步深入研究。

因此，紫外诱变可作为选育高效耐盐木霉突变菌株的有效方法。同时，利用植物与盐渍土中有益微生物的共生关系缓解盐渍土对植物生长造成的不利影响，可为提高植物的耐盐性及盐渍土的生物改良提供一条新思路，但是目前有关木霉菌耐盐机理还有待深入研究。