从氧化炎症级联反应角度探讨淫羊藿素对心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

陈建宁，刘国祥，汪文略，叶嘉民，杨宇博，彭燕婷，陈 浩，顾乔乔，黄志华，黎 晓

(赣南医学院 1.2016级本科生；2.2015级本科生；3.2017级本科生；4.基础医学院，江西 赣州 341000)

急性心肌梗死是当前全世界死亡的主要原因之一，临床上采用的各种介入治疗和溶栓治疗手段在恢复血液灌流及氧供应的同时，常可导致缺血区域活性氧(ROS)的大量释放，从而进一步加重心肌损伤，形成心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)[1]。心肌缺血再灌注损伤机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应、Ca2+超载、细胞凋亡和自噬等多方面[2-6]，其中体内氧自由基大量产生并堆积而导致的氧化应激损伤是最重要的机制之一[7]。文献表明，I/R可以通过黄嘌呤氧化酶NAPDH氧化酶系统、线粒体电子传递酶链和一氧化氮合酶解偶联等产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)[8]，后者可作为第二信使介导诸如炎症反应[9]等的发生。另有研究称，活性氧的增加是炎症小体活化的关键因素[10]。因此，调节活性氧的释放继而调节抗炎和抑炎因子的平衡，即调控氧化炎症级联反应可达到保护损伤组织的作用。

淫羊藿素(Icaritin, ICT)，是淫羊藿苷的代谢产物，属于植物雌激素类化合物，在骨质代谢、心血管系统和免疫调节等方面具有广泛的生物活性[11]。已有文献报道，ICT可以对MIRI大鼠发挥抗氧化应激损伤和抗炎作用[12]。为了进一步明确ICT保护心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制，本实验采用结扎左前降支冠状动脉后再通的方法，构建心肌缺血再灌注损伤模型，检测经淫羊藿素治疗后，各组大鼠心肌组织或血清中氧化应激性指标及炎症因子IL-1β的变化情况，从氧化炎症级联反应角度阐述其可能的作用机理，现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物雄性SD大鼠40只，体重250～280 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[动物中心许可证：SCXK(湘)20160002，动物合格证号：43004700048216，级别：SPF级]。

1.2试剂及药物淫羊藿素(C21H20O6)，分子量为368.38，黄色粉末，由上海天习化工有限公司提供，纯度99%以上，使用时采用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解。DMSO购自Sigma公司(货号：T887725G)。氧化应激检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其中包括SOD试剂盒(货号：A001)、GSH-Px试剂盒(货号：A005)、MDA试剂盒(货号：A0031)。 ELISA试剂盒(购自R&D Systems，货号：RLB00)；HE染色试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司，货号：G1120)；反转录试剂盒(购自invitrogen公司，货号：C28025)；SYBR®Select Master Mix: Life technologier(货号：4472908)；引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3实验方法

1.3.1实验分组与给药实验大鼠随机分为5组，每组8只：假手术组(腹腔注射等剂量的DMSO)、I/R损伤模型组(腹腔注射等剂量的DMSO)、ICT低、中、高剂量治疗组(腹腔注射，剂量分别为0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1)。

1.3.2大鼠I/R损伤模型的制备大鼠腹腔注射后，仰卧固定，行气管插管，连接动物呼吸机(潮气量4 mL·100 kg-1，呼吸频率60次/min，呼吸比1.2∶1)，调整至大鼠呼吸起伏与呼吸机频率一致。肢体Ⅱ导联心电图监测，连续记录。在胸骨左缘第3～4肋间开胸，暴露心脏，打开心包；于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支(LAD)，并用无创缝合针6/0丝线于LAD下穿过，完成结扎。缺血成功的标准：肉眼可见结扎线下心脏左室壁变暗变紫, 心尖部变白, 心电图示ST段明显上抬 (>0.25 mV) ;缺血45 min后, 剪断结扎线, 恢复心肌供血, 再灌注60 min。再灌注成功的标准:左心室和心尖部变红润、ST段回落。假手术组只穿线不结扎，其他操作与模型组同。

1.3.3心肌组织生化指标测定再灌注60 min后，取心肌组织匀浆，按照试剂盒说明书使用酶标仪测定SOD、GSH-Px、MDA。

1.3.4HE染色再灌注结束后，取心肌组织固定脱水、石蜡包埋、切片，按HE试剂盒说明书进行HE染色操作，观察心脏病理学改变。

1.3.5ELISA检测IL-1β含量再灌注结束后，取心肌组织匀浆，按照试剂盒说明书使用酶标仪测定IL-1β水平；经腹主动脉取血，按照试剂盒说明，测定血清IL-1β水平。

1.3.6Realtime-PCR方法检测IL-1βmRNA表达再灌注结束后，取心肌组织匀浆，用TRIzol提取总RNA, 酶标仪测定总RNA的浓度和纯度，并按照说明书进行后续反转录操作，反转录结束后进行实时定量PCR实验。q PCR体系：cDNA 2 μL。反应条件：95 ℃预变性20 min，PCR反应，95 ℃变性10 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40个循环。见表1。

表1 IL-1β， GAPDH，β-actin 引物序列

2 结 果

2.1ICT对MIRI大鼠GSH-Px、SOD、MDA的影响如图1所示，与假手术组相比，I/R组大鼠组织GSH-Px活力降低(P<0.05)、SOD活力显著下降(P<0.01)、MDA含量上升(P<0.05)；1 mg·kg-1ICT治疗后大鼠心肌组织GSH-Px、SOD活力升高(P<0.05)、MDA含量下降(P<0.05)，提示1 mg·kg-1ICT治疗效果更好。

注：与假手术组相比*P<0.05，**P<0.01；与模型组相比# P<0.05。

2.2ICT对MIRI大鼠心肌组织结构的影响如图2所示，假手术组心肌组织未见明显的病理改变，横纹较清晰，呈正常态；I/R组大鼠心脏组织病理学改变明显，心肌间质有炎性细胞浸润(箭头所指处)，部分心肌细胞变性、坏死，肌束排列不整齐，出现收缩带，并可见肌丝断裂溶解态；ICT治疗后各组肌束紊乱程度有所降低，心肌纤维排列较整齐，呈长条形，心肌细胞部分轻度肿胀，且间质炎性细胞浸润减少，损伤程度明显改善。

图2 淫羊藿素对MIRI大鼠心肌组织结构的影响

2.3ICT对MIRI大鼠心肌组织或血清中IL-1β的影响如图3所示：相比较于假手术组，模型组中IL-1β mRNA水平上升(P<0.05)；相比于模型组，ICT治疗后降低IL-1β mRNA水平(P<0.05)和血清IL-1β含量(P<0.05)，而对组织中IL-1β含量变化不明显。

注：与假手术组相比*P<0.05；与模型组相比# P<0.05。

3 讨 论

心肌缺血时，心肌细胞代谢异常可导致琥珀酸的大量积累，并于再灌注时迅速氧化，最终导致活性氧的产生[13]，活性氧随后开放线粒体(m PTP)孔，通过放大级联效应造成更多ROS的释放[14]，后者可经GSH、SOD等清除，故检测GSH、SOD等相关抗氧化酶类物质的含量往往可作为观测活性氧的伤害程度[15]。在再灌注期，伴随一种自相矛盾的组织反应，可促进活性氧和氮物质的产生，并促进缺血组织中促炎性免疫细胞的螯合，能快速诱导多种炎症因子，包括IL-1β、IL-18和TNF-α等释放，进而放大组织损伤，这已被广泛认可是心肌缺血再灌注损伤的主要机制之一，目前受到众多学者的关注。大量研究表明，ROS介导了经典炎症信号通路的发生，其介导作用可能与TLR4或NF-KB信号有关，可进一步造成IL-1β、TNF-α的上调，从而加重炎症反应；当使用了ROS清除剂后，炎症的损伤作用随即减轻[16]，这些结果均提示ROS是炎症产生的重要调控因素。此外，在抗肝纤维化的实验研究中，平键等发现淫羊藿苷能抑制NF-KB活化及核转位抑制肝纤维化[17]，提示淫羊藿苷可能参与了炎症路径的调控。

因此，为了探究淫羊藿素(ICT)治疗心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制，我们采用了多种方法检测了相应指标。实验结果显示，ICT能提高心肌组织中GSH、SOD的活性，并下调MDA的含量；同时，HE染色结果也显示，ICT可有效改善心肌缺血再灌注后大鼠心肌细胞的变性坏死，降低炎性细胞浸润，这些证据证实了zhang等[18]的观点：ICT可能通过降低活性氧，进而减轻炎症反应强度，并最终保护心肌组织免受损伤。同时，我们采用RT-PCR方法检测了ICT对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中IL-1βmRNA表达的影响，结果表明，ICT能够有效降低IL-1βmRNA的表达，进一步运用ELISA实验方法检测了实验各组大鼠心肌组织及血清中IL-1β的含量，结果显示，ICT明显降低其IL-1β的含量。

综上，ICT可能通过抑制MIRI大鼠氧化性损伤及炎症反应带来的级联效应发挥保护心肌的作用，其机制可能与活性氧(ROS)促进缺血组织中促炎细胞的螯合，诱导炎症因子的释放，进而放大组织损伤有关，这种由炎性损伤带来的细胞死亡，被称作为细胞焦亡(pyroptosis)，是新近研究发现的一种新的程序性细胞死亡方式，这或许为今后对MIRI的干预研究带来了新的挑战，我们拟于下一步继续探讨。