MDCK贴壁细胞中ZO-1蛋白的表达研究

冶 金，王美皓，敖慧娟，杨 琨，阿依木古丽，乔自林，柏家林*

（1.西北民族大学 生物医学研究中心/生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

MDCK细胞系是由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬的肾脏组织中分离培养所建立[1]，其在培养过程中合成紧密连接（tight junction, TJ）蛋白分泌至细胞表面形成单细胞层[2]，呈上皮样细胞形态学特征，通常为贴壁培养并且能连续传代。随着国内外大规模细胞培养技术的不断成熟和被应用，流感病毒疫苗的制备也逐渐由哺乳动物细胞系取代传统鸡胚为生产基质[3]，其中MDCK细胞由于对不同流感病毒株具有易感染、易培养、增殖快且病毒不易变异等特点[4]，被公认为是最适于流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一[5]。

紧密连接是上皮细胞间的一种重要连接方式[6]，主要由TJ蛋白组成，负责调控细胞旁离子和溶质分子的跨膜运输以及维持细胞极性状态[7]，在细胞中最初发现紧密连接就是由于其可通过细胞旁路途径控制渗透作用[8]。1986年Steveson[9]首次发现与细胞紧密连接相关的蛋白ZO-1（zonula occludens-1，闭锁小带蛋白1），同时有研究发现在无紧密连接的非上皮细胞中也存在ZO-1蛋白的表达，与粘附连接直接相连[10]。上皮细胞中的ZO-1蛋白则通过跨膜蛋白连接至细胞骨架处[11]，在TJ蛋白的形成、维持上皮组织正常结构和功能以及调控细胞分化、增殖和迁移等生理活动中发挥重要作用[12]，与细胞成瘤性有着密切关系。

本文拟通过应用免疫组化及荧光染色检测MDCK贴壁细胞中ZO-1蛋白表达情况，为研究MDCK贴壁细胞内源性蛋白表达及功能作用提供数据支持，为探究ZO-1蛋白与MDCK细胞的成瘤性作用奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 MDCK贴壁细胞，由西北民族大学生物医学研究中心提供。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、0.25%胰酶和PBS（兰州百灵生物技术有限公司）；新生牛牛血清（兰州民海生物有限公司）；4%多聚甲醛（武汉博士德生物工程有限公司）；闭锁小带蛋白1抗体、SP免疫组化试剂盒、FITC标记的羊抗兔IgG、DAPI染液和免疫荧光抗淬灭封片剂（北京博奥森生物技术有限公司）；增强型DAB显色试剂盒和Mayer苏木素染液（大连美仑生物技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞爬片制备 将经多聚赖氨酸处理的盖玻片置于6孔板中，按1×106/ml 的细胞密度将已消化的细胞接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养3 h左右。

1.2.2 SP法免疫组化染色 将细胞爬片从培养板中取出，PBS清洗；滴加4%多聚甲醛室温固定20 min；滴加0.5%Triton X-100通透20 min；滴加3%H2O2，室温孵育15 min以消除内源性过氧化物酶活性，然后滴加封闭用正常山羊血清工作液，37℃ 孵育20 min；用吸水纸吸去封闭液；滴加稀释度为1:100的闭锁小带蛋白1抗体，37℃ 孵育2 h；滴加生物素化二抗工作液，37℃ 孵育20 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃ 孵育20 min；显色液DAB显色，苏木素复染后在显微镜下观察并进行封片。

1.2.3 免疫荧光染色 将细胞爬片从培养板中取出，PBS清洗；滴加4%多聚甲醛室温固定20 min；滴加0.5%Triton X-100通透20 min；滴加3%H2O2，室温孵育15 min以消除内源性过氧化物酶活性，然后滴加封闭用正常山羊血清工作液，孵育20 min；用吸水纸吸去封闭液；滴加稀释度为1:100的闭锁小带蛋白1抗体，37℃ 孵育2 h；滴加稀释度为1:100的FITC标记的羊抗兔IgG 荧光二抗于37℃ 避光孵育1 h；滴加DAPI染液室温孵育5 min，PBS清洗（×4）；用吸水纸吸去细胞爬片上的液体，使用免疫荧光抗淬灭封片剂封片后在荧光显微镜下观察并采集图像。

2 结果

2.1 SP免疫组化法检测ZO-1蛋白在MDCK贴壁细胞中的表达

实验阴性对照使用PBS为一抗对MDCK贴壁细胞进行免疫组化染色，结果显示ZO-1蛋白主要在胞核及胞浆中表达，呈棕褐色、浅褐色颗粒。通过免疫组化图可以观察出，ZO-1蛋白在胞核中表达较多，颜色较深，在胞浆中表达较少，颜色较浅，详见图1。

图1 免疫组化染色结果

2.2 免疫荧光染色检测ZO-1蛋白在MDCK贴壁细胞中的表达

为确认免疫组化染色结果的准确性，采用免疫荧光染色检测ZO-1蛋白在MDCK贴壁细胞中的表达情况。经DAPI染色后在显微镜下可观察到蓝色荧光的细胞，正常细胞核核形完整，染色质均匀，非正常细胞核破裂成碎片，染色质固缩，向外周聚集成周边化。与ZO-1蛋白Ⅰ抗和带有FITC特异标记的Ⅱ抗结合后，含有ZO-1蛋白的细胞会发绿色荧光为阳性，无ZO-1蛋白的无绿色荧光为阴性。在细胞核中可见强度较强的绿色荧光，胞浆中也有绿色荧光出现，但强度不强。结果表明ZO-1蛋白在MDCK贴壁细胞中胞核表达高于胞浆表达。

图2 免疫荧光染色结果

3 讨论

ZO-1不仅构成细胞间紧密连接，而且间接参与细胞骨架形成，已有研究证明ZO-1与肿瘤细胞的初发及扩散存在密切联系[13]，其表达异常可引起紧密连接结构与功能异常并导致肿瘤细胞侵袭转移。本研究发现MDCK贴壁细胞正常培养状态下，胞核ZO-1蛋白表达强，可能说明ZO-1蛋白在其细胞致瘤性方面发挥作用。Balda等发现ZO-1与肿瘤分化程度相关，可能是由于细胞连接中ZO-1蛋白的减少，导致肿瘤细胞扩散能力的增强[14]；Tada等发现在大鼠脑动脉瘤的发生中观察到了ZO-1蛋白的表达减少，并认为其与内皮细胞损伤和巨噬细胞的迁移有关[15]。

MDCK细胞作为生产流感病毒疫苗的最适细胞系，成瘤性强弱亦是影响其生物制品质量关键，已确定ZO-1蛋白在MDCK贴壁细胞中表达，但ZO-1是否影响MDCK细胞成瘤还需进一步研究。