HPLC法测定头孢噻肟钠乙酸含量

冯丽雄,彭 莺,吴伟东,万恒兴

(深圳技师学院应用生物系，广东 深圳 518116)

头孢噻肟钠又名：凯福隆、头孢氨噻肟、西孢克拉瑞、CTX[1]，是第三代头孢菌素类抗生素，抗菌谱广,对大肠埃希菌、奇异变形杆菌、克雷伯菌属和沙门菌属等肠杆菌科细菌等格兰阴性菌有强大活性,对普通变形杆菌和枸橼酸杆菌属亦有良好作用[2]。抗菌机制是抑制细菌细胞壁的形成[3-4]，在临床上主要用于治疗由各种敏感菌引起的的感染，如呼吸道、皮肤软组织、泌尿系统、创伤及术后等感染[5]。乙酸是第三类残留溶剂[6]。实际生产中，由头孢噻肟酸制成头孢噻肟钠无菌原料时，选择乙酸钠与头孢噻肟酸进行复分解反应，生成头孢噻肟钠和乙酸。乙酸为头孢噻肟钠合成过程中可能生成的副产物[7]。目前对乙酸的分析方法主要要有滴定法、薄层层析法、分光光度法、荧光法、气相色谱法以及酶法等[8]。本文建立高效液相色谱法测定头孢噻肟钠乙酸残留溶剂的检验方法，用于控制头孢噻肟钠乙酸残留量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Acquity H-Class高效液相色谱仪，Empower 色谱工作站；瑞士Mettler Toledo BP211D XP205分析天平；德国默克Milli-Q IQ7000超纯水系统。

1.2 试药

头孢噻肟钠原料药(批号 100100-1、100100-2、100100-3、100200-1、100200-2、100200-3)；甲醇色谱纯；乙酸、磷酸为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbox Edipse XDB C18(4.6 mm×150 mm，5μm)；流动相：量取1mL磷酸和10mL甲醇，用水稀释到1000mL，用前过滤脱气；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

2.2 溶液的制备

乙酸对照溶液: 精密称定乙酸50mg置100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度；精密移取该溶液5mL，置25mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，即得。

供试品溶液：精密称定头孢噻肟钠原料100mg置10mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，即得浓度为10 mg·mL-1的供试品溶液。

线性储备液：精密称定乙酸50mg置100mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，即得。

空白溶液的配制：用流动相作为空白溶液。

2.3 系统适用性试验

取对照溶液20μL 注入液相色谱仪，连续进样对照溶液6针。记录色谱图，结果见表 1 及图 1。本实验乙酸峰理论塔板数和乙酸峰面积的相对标准差(RSD%)作为系统适用性实验考察指标。乙酸峰面积的相对标准差应不超过5.0%；乙酸峰理论塔板数不低于3000。

表1 系统适用性试验结果

图1 系统适用性色谱图Fig.1 Chromatogram of system suitability

2.4 线性关系的考察

取线性储备液适量，加流动相稀释制成质量浓度分别为0.02、0.03、0.05、0.1、0.12、0.15、0.2 mg·mL-1的单一成分溶液，取上述溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以质量浓度X(mg·mL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，并按照斜率法计算各杂质的相对校正因子，乙酸的峰面积对浓度线性回归的相关系数为0.9999。Y轴截距在100%响应值的25%以内，各浓度的响应因子的相对标准差为3.4%。试验结果见表2及图2。

表2 线性结果表

表2(续)

图2 线性回归方程Fig.2 Linear Regression equations

2.5 检测下限与定量下限试验

取乙酸对照溶液适量，加流动相稀释制成适当浓度的溶液，取 20μL进样分析。以信噪比 S/N=3为指标，重复进样6次，进样浓度为4.0ng·mL-1，即检测下限为 0.08ng(0.0008%)，RSD为4.6%；以信噪比 S/N=10为指标，重复进样6次，进样浓度为20.0 ng·mL-1，即定量下限为0.40 ng(0.004%)，RSD 为 2.9%。

2.6 稳定性考察

对照溶液稳定性：取乙酸对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件，在2～8℃下避光保存放置 0、1、2天，进样20μL，乙酸含量与0天配制的标准溶液比较，放置1天和放置2天回收率分别为99.03%和99.11%，对照溶液在两天内稳定性良好。

供试品溶液稳定性：取供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，在2～8℃下避光保存放置 0、12、24、36、48、60、84、96、108、120、132min，进样20μL，与0min初始配制的溶液进行比较，计算乙酸的变化率。结果见表3，供试品溶液杂质中的乙酸随时间延长而增大，放置132min时，乙酸杂质增加35.2%。供试品溶液在48min内乙酸浓度的变化率小于10.0%。

表3 稳定性结果表

表3(续)

2.7 重复性试验

按“2.2”项下的供试品溶液制备方法，平行制备6 份供试品溶液，并按“2.1”项下的色谱条件进样分析，以峰面积计算其 RSD。乙酸峰面积的RSD为3.6% ，表明本方法重复性良好。

2.8 精密度试验

进样精密度：取供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，连续进样 6 次，按峰面积计算其 RSD。乙酸峰面积的 RSD 为3.9%，表明本方法重现性良好。

中间精密度：分别以不同人员(2 人)、不同时间(连续3 d)、不同仪器(Agilent 1260；Waters 2489 高效液相色谱仪)按重复性试验项下方法进行分析。结果显示，乙酸峰面积的 RSD均小于 5.0%。表明本方法精密度良好。

2.9 耐用性考察

取供试品溶液，通过改变“2.1”项下的色谱条件，包括流速、柱温、色谱柱，考察对乙酸测定结果的影响，结果见表 4。乙酸含量回收率在93%～105%范围内。试验数据表明，当色谱柱条件发生变化时，乙酸含量的测量值波动较大，RSD 为6.62%。因此本试验需严格控制色谱条件，选择固定的厂家型号的色谱柱，才可保证方法重现性良好。

表4 耐用性考察结果

表4(续)

2.10 专属性试验

2.10.1 溶剂干扰的考察

取对照溶液及空白溶液各20μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果显示，对照溶液乙酸出峰时间在3.4 min,空白溶液峰在乙酸峰出峰时间处无干扰。

2.10.2 峰纯度试验

取对照溶液20μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算纯度角，结果见表5。结果显示，乙酸峰的纯度角小于纯度阈值，纯度满足要求。

表5 乙酸峰纯度试验结果

2.11 样品检测

精密称取供试品适量，加流动相溶解并稀释制成每1mL中约含10μg的溶液，作为供试品溶液。分别取对照溶液和供试品溶液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表 6。在检测的6批样品中，乙酸含量均小于0.5%，表明本产品的乙酸杂质符合要求。

表6 样品检验结果

3 讨论

在溶液稳定性实验中，对照品溶液在2～8℃下避光保存2天内保持稳定，而供试品溶液在该存储条件下不稳定，建议在测定头孢噻肟钠乙酸含量时供试品需要现配现进。

耐用性考察实验中，改变不同厂家的色谱柱(均是C18 4.6 mm×150 mm，5μm)，乙酸含量的测量值波动较大，RSD 为6.62%，为了确保良好的重现性，建议选择固定的厂家型号的色谱柱，特别是用于长期稳定性考察样品的分析，更换色谱柱会影响乙酸杂质趋势分析。

通过实际样品的检测，发现在1.5 倍主峰保留时间以后，没有杂质峰出现，为提高试验效率，将乙酸的运行时间定为12 min，保证了测定结果的可靠性。

4 结论

本试验建立了高效液相色谱法测定头孢噻肟钠原料乙酸杂质含量，并对方法的有效性和检出能力进行了评价。结果表明，该方法简便、准确，可以用于头孢噻肟钠原料乙酸杂质测定，也可以为该药制剂的质量研究提供参考。