大孔吸附树脂纯化紫花地丁总黄酮工艺研究

魏福荣

(江苏吉贝尔药业股份有限公司，江苏 镇江 212009)

紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁ViolayedoensisMakino的干燥全草，性苦、辛、寒，归心、肝经，具有清热解毒，凉血消肿的功效，主要用于疔疮肿毒，痈疽发背，丹毒，毒蛇咬伤[1]。紫花地丁含黄酮类、香豆素类、有机酸、酚类、生物碱、皂苷、多糖、氨基酸、多肽及蛋白质、植物甾醇等多种有效成分[2]。现代药理研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、抗炎、抗癌及抗心脑血管疾病等作用[3]。本实验选取9种大孔树脂，通过静态吸附-解吸筛选出相对较优的大孔树脂，再以总黄酮质量分数为指标，考察大孔树脂分离纯化紫花地丁总黄酮的吸附流速、上样量和洗脱条件，优选出大孔树脂纯化紫花地丁总黄酮的条件，为紫花地丁的开发利用提供实验依据。

1 材料与试剂

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-201408)；紫花地丁(亳州市亳广中药饮片有限公司)；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠(国药化学试剂集团有限宝恩吸附材料科技有限公司)；双蒸水(自制)；其余试剂均为分析纯。

UV2550紫外可见分光光度计(日本岛津)；BAS20S(赛多利斯科学仪器有限公司)；BuchiR-200旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；W系列微粉碎机(江阴市满达机械设备有限公司)；HC数控超声波清洗机(昆山禾创超声仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 紫花地丁总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的配制

精密称取经120℃干燥至恒重的芦丁对照品10.18 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加无水乙醇适量，置水浴微热，溶解放冷并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得0.2036 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。

2.1.2 检测方法[4]

分别吸取1 mL样品置10 mL量瓶中，精密加入50 mg/mL亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，再精密吸取100 mg/mL的硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，然后加50 mg/mL NaOH 4 mL，分别加无水乙醇至刻度，摇匀，放置15 min。以空白试剂做参比，在510nm波长出测定吸光度。

2.1.3 线性关系考察

精密量取“2.1.1”项下的芦丁对照品溶液0.8，1.2，1.6，2.0，3.0 mL，置10 mL容量瓶中，按“2.1.2 检测方法”进行显色，于510 nm处测定吸光度值。以吸光度值Y为纵坐标，以质量浓度X为横坐标，绘制标准曲线，得芦丁的回归方法：Y=12.172X+0.0034，r=0.9996，在0.01629 mg/mL～0.06108 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 上柱液的制备[5]

将干燥的紫花地丁全草粉碎过40目筛，加入30倍量的64%乙醇，温度为72℃用超声波振荡器(功率161W)振荡32min，滤过，残渣再重复振荡2次，三次滤液合并，回收乙醇至无醇味，加纯净水稀释20倍，备用。经检测该稀释液中总黄酮质量分数为1.93 mg/mL。

2.2 树脂的筛选

2.2.1 树脂的预处理

分别取9种大孔树脂AB-8、D101、X-5、HPD400、HPD600、HPD826、NKA-Ⅱ、ADS-17、HP20，用95%乙醇浸泡一段时间，装柱，用5%NaOH洗脱2.5BV，后用水洗脱至中性；再用5%HCl 洗脱2.5BV，用水洗脱至中性。

2.2.2 静态吸附-解吸试验

准确称取经过预处理的9种大孔树脂AB-8、D101、X-5、HPD400、HPD600、HPD826、NKA-Ⅱ、ADS-17、HP20各5g，置250 mL磨口三角瓶中，分别精密加入“2.1.4”项下制备的上柱液50 mL(黄酮质量分数为1.93 mg/mL)，25℃下至摇床中于150 r/min下振摇24 h，使之充分吸附，根据吸附前后浓度的差值，计算出平衡吸附量。取上述吸附饱和的9种大孔树脂AB-8、D101、X-5、HPD400、HPD600、HPD826、NKA-Ⅱ、ADS-17、HP20用去离子水洗涤后，分别加入70%乙醇100 mL，25℃下至摇床中于150 r/min下振摇6 h，使之充分解吸，测定洗脱液浓度，计算出洗脱率。结果见表1。

吸附率=(吸附前总黄酮质量浓度-吸附后总黄酮质量浓度)/吸附前总黄酮质量浓度

解吸率=解吸附后总黄酮质量浓度/(吸附前总黄酮质量浓度-吸附后总黄酮质量浓度)

总黄酮回收率=吸附率×解吸率

表1 树脂型号筛选结果Table1 Results of resin type screening

由表1结果可知，以总黄酮回收率为主要考察指标，在静态吸附-解吸实验中的D101型大孔树脂总黄酮回收率高于其他树脂，选择D101型大孔树脂纯化紫花地丁总黄酮。

2.3 大孔吸附树脂纯化工艺优选

2.3.1 吸附流速的确定

取“2.1.4”项下制备上柱液100 mL(黄酮质量分数为1.93 mg/mL)，分别以1，1.5，2 mL/min流速通过10g已处理好的D101型大孔树脂，进行动态吸附。流出液按照“2.1.2”项下的检测方法测定，分别计算各自吸附量。由表2可见，随着吸附流速加快，吸附量越小，总黄酮的泄漏愈加严重，故选择吸附流速为1 mL/min为宜。

表2 不同吸附流速对吸附效果的影响Table 2 Effects of different adsorption velocity on the adsorption

2.3.2 上样量的考察

图1 泄露曲线Fig.1 Leakage curve

准确称取预处理后的D101型大孔树脂10 g，湿法装柱，加入按“2.1.4”项下制备上柱液150 mL(黄酮质量分数为1.93 mg/mL)，上柱吸附。分段收集经吸附后的样品液，每10 mL收集一份。选择测定其浓度，以流出液中总黄酮浓度为纵坐标，流出体积为横坐标，绘制动态吸附曲线，结果见图1。由图1可知当流出液体积达到110 mL时，黄酮开始大量泄露，即已达到饱和吸附。故饱和上样量为110 mL。

2.3.3 洗脱溶剂的选择

精密称取预处理的D101大孔吸附树脂10 g，取上柱液100 mL(黄酮质量分数为1.93 mg/mL)进行动态吸附，吸附完全后，先用100 mL水冲洗，再依次以30%，50%，70%，95%乙醇各100 mL进行梯度洗脱，每20 mL收集一份。测定每份样品总黄酮的量，以流出体积为横坐标，总黄酮质量浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线。由表2可以看出，70%乙醇的转移率更高，故选择70%乙醇为洗脱溶剂。

2.3.4 乙醇洗脱量的确定

取经过吸附饱和的树脂，先用一定量的去离子水洗至洗脱液颜色近无色，再以70%的乙醇洗脱，分段收集洗脱液，每10 mL一份，共10份。分别测定洗脱液中总黄酮质量浓度，以洗脱体积(BV)是树脂的倍数为横坐标，以洗脱率为纵坐标绘制动态洗脱曲线。由图3可知，洗脱剂用量为8 BV时，总黄酮基本被洗脱，总黄酮洗脱率为97.56%。

图3 洗脱量的考察Fig.3 Investigation of eluant volume

2.3.5 工艺验证试验

精密称取预处理好的D101大孔树脂10 g，3份，按照上述优选的纯化条件(吸附流速 1 mL/min、上样量110 mL、70%乙醇洗脱8BV)进行试验，洗脱液减压浓缩，冷冻干燥，称重，测定总黄酮含量，结果其中总黄酮质量分数为61.84%，62.88%，61.96%(RSD=0.91%)，表明纯化工艺稳定可行。

3 讨论

不同型号的大孔吸附树脂由于其本身极性、比表面积、孔径等不同而使自身对于同一物质的吸附能力和解吸能力有所不同，从而产生不同的吸附效果。

通过静态吸附-解吸实验，以总黄酮回收率为主要考察指标，发现D101型大孔树脂的总黄酮回收率高于其他大孔吸附树脂，故选择D101型大孔树脂纯化紫花地丁总黄酮。在纯化工艺优化中，选择吸附流速为1 mL/min、紫花地丁总黄酮的稀释液上样量为110 mL(黄酮质量分数为1.93 mg/mL)和采用70%乙醇洗脱8BV的工艺条件，并通过平行的3次工艺验证试验，按照上述优化的纯化工艺条件，经减压浓缩、冷冻干燥后得到了紫花地丁总黄酮质量分数为61.84%，62.88%，61.96%。该大孔树脂纯化工艺简单可行，为紫花地丁总黄酮的工业化生产提供了理论依据。