MitoQ对模拟高原缺氧大鼠脑组织的保护作用

蒙 萍，景临林，何 蕾，高迎春，李玉芳，马慧萍

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九四○医院药剂科全军高原环境损伤防治重点实验室；2. 甘肃省妇幼保健院麻醉手术科，甘肃 兰州 730050)

高原低压性缺氧是人类在高海拔区域面临的重要挑战，是引起急性高原反应和高原脑水肿、高原肺水肿等高原性疾病的首要因素[1]。缺氧引起氧化应激，活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量产生，造成机体过氧化损伤、线粒体功能障碍等[2]。多年来，研究人员致力于抗氧化剂的研究，认为抗氧化剂能够清除机体过多产生的ROS，缓解氧化应激损伤[3]。然而，大量的ROS主要产生于线粒体，基于线粒体的双层膜结构，普通的抗氧化剂并不能穿过其双层膜到达线粒体内部发挥作用，使得抗氧化剂的效果并未能得到最大程度的发挥，人们开始研究线粒体靶向抗氧化剂来治疗相关疾病[4]。其中一个很好的方法是结合阳离子脂质体如三苯基膦，磷的衍生物已经被广泛的用于靶向药物的设计，使药物有靶向线粒体内膜的特性。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ(Mitoquinol mesylate)是内源性抗氧化剂辅酶Q10与三苯基磷共价结合得到的一个化合物，是一种具有线粒体靶向特性的抗氧化剂，已经被广泛用于多种疾病的预防和治疗[5]。有研究显示，MitoQ对神经退行性疾病的细胞和动物模型都有神经保护作用，能明显抑制6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病(Parkinson′s disease，PD)模型中Drp1向线粒体迁移，阻碍线粒体分裂机制的激活，同时抑制促凋亡蛋白Bax转位到线粒体，抑制PD的发生[5]。但MitoQ对高原缺氧损伤防治方面尚无相关研究，因此，本研究采用大型低压氧舱模拟海拔8 000 m高原缺氧环境，通过脑组织病理切片观察，测定大鼠脑组织氧化应激水平、线粒体呼吸链复合物活性和凋亡蛋白的表达，研究MitoQ对高原缺氧大鼠脑组织的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2药物与试剂 MitoQ为本课题组景临林博士合成惠赠；丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒(批号：20150417)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒(批号：20150421)、线粒体呼吸链复合物Ⅰ测定试剂盒(批号：20151020)、线粒体呼吸链复合物Ⅱ测定试剂盒(批号：20150513)、线粒体呼吸链复合物Ⅳ测定试剂盒(批号：20150513)、Ga2+测定试剂盒(批号：2014.12.20)，均购自南京建成生物工程研究所；膜电位测定试剂盒(碧云天，批号：C2006)；抗体Bax(货号：ab32503)、细胞色素C (cytochrome C，Cyt C)(货号：ab133504)，均购自Abcam公司；caspase-3抗体(Cell Signaling，批号：0071)；β-actin抗体(中杉金桥，批号：150120)。

1.1.3仪器 大型低压氧舱(贵州风雷军械有限公司)；低温高速离心机(德国Sigma公司)；MULTISKAN MK3型酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司)；免疫印迹分析仪(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1MitoQ对常压密闭缺氧小鼠的保护作用 取♂BALB/c小鼠，共18只，随机分为6组，每组3只。分别腹腔注射不同剂量的MitoQ(1、3、5、10、20 mg·kg-1)，对照组腹腔注射等剂量的生理盐水，给药0.5 h后，依次将小鼠放入250 mL广口瓶中(为了避免小鼠因为自呼吸产生的CO2而酸中毒产生多因素死亡原因，加入了5 g钠石灰，用来吸收CO2[6])，瓶口涂抹适量的凡士林并拧紧瓶塞，立即开始计时至其死亡，记录存活时间，计算存活时间延长率。

1.2.2模拟海拔8 000 m高原缺氧实验 将60只♂Wistar大鼠随机分成5组，包括正常组、缺氧12 h模型组、缺氧12 h MitoQ组、缺氧24 h模型组、缺氧24 h MitoQ组，每组12只。按小鼠常压密闭缺氧实验得到的MitoQ最佳给药剂量，换算成大鼠给药剂量为3.5 mg·kg-1，将大鼠分别称重后腹腔注射给药，MitoQ为每天早上新配，连续给药3 d。d 3早上给完药后0.5 h，放入大型低压低氧模拟舱。将大鼠按组别放入实验舱，关闭实验舱舱门，以20 m·s-1的速度升高至海拔8 000 m，缺氧12 h后，实验人员进入操作间，关闭操作间舱门，以2 m·s-1的速度升高海拔至3 500 m，同时将实验舱海拔降低至3 500 m，打开实验舱舱门，实验人员进入实验舱后迅速取出缺氧12 h组大鼠，实验舱复升压至海拔8 000 m，实验人员在海拔3 500 m操作间麻醉大鼠解剖采集大鼠脑组织。缺氧24 h组与缺氧12 h组操作步骤一致，正常组大鼠正常饲养24 h后麻醉取材。

1.2.3HE染色 将大鼠解剖，取出脑组织皮层，漂洗，纵切厚1 mm切片，放入含有4%甲醛的固定液中。固定1周后，制样与显微镜观察、拍片。

1.2.4氧化应激相关指标的测定 按脑组织(重量) ∶生理盐水(体积)=1 ∶9的比例，使用电动匀浆器冰浴制备10%脑组织匀浆，按照MDA、SOD试剂盒说明书测定。

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1.2.5线粒体功能与能量代谢相关指标的测定

1.2.5.1大鼠脑组织Ga2+含量的测定 制备10%脑组织匀浆，按照Ga2+试剂盒说明书进行测定。

1.2.5.2大鼠脑组织线粒体的提取 参考文献[7]，解剖取出大鼠脑组织，彻底漂洗干净至无血迹，称重0.1 g，转移至玻璃匀浆器中，按如下步骤提取线粒体：① 加入1 mL大鼠脑线粒体分离介质，匀浆破碎组织块释放出细胞器；② 将匀浆好的样品转移至2 mL离心管内，1 000×g离心10 min；③ 将上清转移至2 mL离心管，10 000×g离心10 min；④ 用棉签将液面以及附着在管壁的油脂擦拭干净，弃上清；⑤ 用线粒体分离介质重悬沉淀，10 000×g离心10 min；⑥ 弃上清，用线粒体分离介质重悬沉淀，分装，-80 ℃保存。

1.2.5.3大鼠脑线粒体膜电位的测定 将线粒体一定量稀释，先在96孔荧光酶标板中加入180 μL JC-1工作液，之后在测定孔加入20 μL待测样品，对照孔每孔加入20 μL PBS，充分混匀，37 ℃孵育20 min，使用荧光酶标仪，激发波长488 nm，发射波长530 nm(绿光)、585 nm(红光)。结果以红光荧光强度/绿光荧光强度表示。

1.2.5.4大鼠脑线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的测定 使用南京建成线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ测定试剂盒，按照说明书进行测定。

1.2.6蛋白免疫印迹分析 称取一定质量的脑组织，加入9倍体积的蛋白质裂解液，中速冰水浴电动匀浆1 min后，冰上裂解45 min，每间隔5 min涡旋5 s，随后12 000 r·min-1离心10 min，吸取上清20 μL用于测定蛋白浓度。定量转移剩余上清于新的离心管中，按比例加入蛋白质上样缓冲液，混匀，变性，-20 ℃冰箱保存。12%的分离胶，5%的浓缩胶，上样50 μg，浓缩胶80 V，分离胶110 V。TBST洗膜后湿法转膜，110 V转膜1.5 h，5%脱脂奶粉封闭2 h。一抗Bax(1 ∶2 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、Cyt C(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜后取出，1×TBST洗膜4次，每次10 min；二抗孵育2 h，再次洗膜4次，每次10 min，ECL超敏发光液A液 ∶B液=1 ∶1配制发光液，曝光仪曝光。

2 结果

2.1 MitoQ对常压密闭缺氧小鼠的保护作用MitoQ对常压密闭缺氧小鼠存活率的影响见Tab 1，给予不同剂量MitoQ后，与缺氧模型组比较，低剂量组并未显现出明显的保护作用，MitoQ(5、10、20 mg·kg-1)明显延长了小鼠的存活时间，小鼠存活率分别提高了47.69%、49.08%和49.05%。由结果可以看出，大于5 mg·kg-1后随着MitoQ给药剂量的增加，其对常压密闭缺氧小鼠的存活率并没有明显变化，因此，最佳剂量选择为5 mg·kg-1。

Tab 1 Effect of MitoQ on survival rate of mice under conditionof atmospheric airtight which lack of

#P<0.05,##P<0.01vsControl

2.2 MitoQ对缺氧大鼠脑组织显微结构的影响如Fig 1所示，正常组大鼠脑组织结构致密，缺氧12 h组细胞间隙增宽，空泡化，血管明显水肿，缺氧24 h组变化更为明显；与模型组相比较，12 h MitoQ组与24 h MitoQ组细胞间隙均减小，血管水肿程度减弱，提示MitoQ对缺氧大鼠脑组织发挥保护作用。

2.3 MitoQ对缺氧大鼠脑组织MDA和SOD的影响SOD被认为是阻止机体免受ROS攻击的首要的防御酶。Tab 2结果显示，缺氧12 h和24 h均能明显提高缺氧大鼠脑组织中MDA水平，对机体产生损伤；MitoQ能够降低MDA的含量，在24 h时降低作用差异具有显著性(P<0.05)。缺氧能够明显降低大鼠脑组织中SOD活力，降低机体对O2-·等氧自由基的清除能力；MitoQ能够在一定程度上提高缺氧大鼠脑组织SOD的活性，增加机体对ROS的清除能力。

2.4 MitoQ对缺氧大鼠脑组织Ga2+的影响如Fig 2所示，与正常组比较，缺氧增加了大鼠脑组织Ga2+含量，引起机体钙超载，在缺氧12 h时差异具有显著性(P<0.05)；给予MitoQ能够明显降低缺氧12 h大鼠脑组织Ga2+含量。缺氧24 h组大鼠脑组织Ga2+含量与正常组相比差异无显著性。

Tab 2 Effect of MitoQ on activity of MDA, SODon rats under hypoxia

**P<0.01vsnormal;#P<0.05vshypoxia

2.5 MitoQ对缺氧大鼠脑组织线粒体膜电位的影响如Fig 3所示，与正常组相比，缺氧能够明显降低线粒体膜电位，对线粒体功能造成损伤；给予MitoQ后，缺氧12 h组大鼠脑组织线粒体膜电位明显升高(P<0.05)，即MitoQ对缺氧大鼠脑线粒体功能具有一定的保护作用。缺氧24 h MitoQ组与模型组相比无明显变化(P>0.05)。

2.6 MitoQ对缺氧大鼠脑线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的影响Tab 3结果显示，缺氧12 h和24 h均使得大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性明显下降(P<0.01)，线粒体呼吸链复合物Ⅳ活性有一定程度的下降；在缺氧24 h时，MitoQ对大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性有一定程度提高，但差异无显著性，能够明显提高大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅱ的活性(P<0.01)。

Fig1EffectofMitoQonbraintissuesofhypoxicratsbyHEstaining(×200) A: Normal; B:Hypoxia 12 h;C: Hypoxia+MitoQ 12 h; D: Hypoxia 24 h; E: Hypoxia+MitoQ 24 h.

Tab 3 Effect of MitoQ on activity of mitochondrial respiratory chain complexes Ⅰ, Ⅱ, Ⅳon rats under hypoxia

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia

Fig 2 Effect of MitoQ on Ga2+ content inbrain tissues of hypoxic

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vshypoxia

Fig 3 Effect of MitoQ on mitochondrial membrane potential inbrain tissues of hypoxic

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05vshypoxia

2.7 MitoQ对缺氧大鼠脑组织凋亡蛋白的影响如Fig 4所示，缺氧24 h组Cyt C、caspase-3、Bax表达较正常组明显提高(P<0.01)；MitoQ组Cyt C、caspase-3、Bax表达较模型组明显下调(P<0.05，P<0.01)。提示缺氧促进大鼠脑组织细胞凋亡，MitoQ能够抑制缺氧条件下大鼠脑组织凋亡蛋白的表达，对缺氧大鼠发挥保护作用。

Fig 4 Effect of MitoQ on expression of Cyt C, caspase-3and Bax in brain tissues of hypoxic

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vshypoxia

3 讨论

高原缺氧使初上高原的人产生各种不适症状，限制了高原地区的发展，严重影响了部队高原作战能力。低压性缺氧是产生高原病的主要因素，造成心功能降低、微循环障碍、氧自由基大量产生，使得机体脂质过氧化水平升高，能量代谢和线粒体呼吸功能障碍，ATP合成减少，诱发一系列细胞凋亡反应，促进机体凋亡蛋白表达，引起细胞凋亡[8-9]。线粒体是人体许多重要的代谢发生的部位，通过氧化磷酸化合成细胞内绝大多数的ATP，三羧酸循环氧化反应的中间产物提供H+和电子进入电子传递链，最终提供能量将ADP磷酸化形成ATP，维持细胞活力。

既往研究显示，MitoQ作为线粒体靶向抗氧化剂，对神经退行性疾病、代谢综合征、多发性硬化、缺血/再灌注损伤、脓毒症等与机体抗氧化系统失衡、氧化应激、线粒体功能障碍相关的疾病，均具有一定的防治作用。在PD模型中，能够明显上调Mfn2蛋白和mRNA水平，并以Mfn2依赖的方式促进线粒体融合，还可以稳定6-OHDA存在下线粒体的形态和功能，抑制ROS的形成，改善线粒体破碎和细胞凋亡[10-11]。此外，MitoQ能够降低高脂饮食小鼠线粒体ROS水平，对动物模型代谢综合征具有一定作用，并且能明显抑制自身免疫性脑脊髓炎模型小鼠的神经炎症，通过抑制炎性细胞因子IL-6、趋化因子及脱髓鞘作用，增加对轴突的保护作用。在脓毒症模型中，MitoQ通过减少ROS和过氧亚硝酸盐的形成，维持脓毒症条件下的线粒体膜电位[5]。

本研究显示，MitoQ明显降低缺氧条件下胞内Ga2+含量，缓解缺氧引起的线粒体膜电位的降低，提高缺氧24 h大鼠脑组织线粒体呼吸链复合物Ⅱ的活性，改善缺氧引起的大鼠线粒体功能障碍。并且明显降低Cyt C、caspase-3和Bax的表达，抑制缺氧条件下凋亡的发生。

综上所述，大型低压氧舱模拟海拔8 000 m高原缺氧环境，引起大鼠脑组织氧化应激，线粒体功能障碍。线粒体靶向抗氧化剂MitoQ可以明显降低缺氧条件下大鼠脑组织脂质过氧化程度，提高抗氧化酶活性，从而提高缺氧大鼠抗氧化水平。同时，MitoQ能够提高线粒体呼吸链复合物活性，维持其线粒体功能，对缺氧大鼠发挥保护作用。